からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録アフリカツメガエル神経筋共培養

この手順の全体的な目標は、シナプス結合脊髄ニューロンとゼノプス胚からの筋肉細胞の初代培養物を取得することです。これは、まず、ヒト絨毛膜アトロピンをオスとメスの両方のカエルに注射し、受精卵を採取することにより、Xenopusで繁殖を誘導することによって達成されます。2番目のステップは、ステージ22の胚からゼリーコートとファテルと膜を取り除くことです。

次に、脊髄ニューロンと筋肉を胚から分離し、皮膚を切除して廃棄します。最後のステップは、単離された細胞を培養皿にプレートし、機能的な神経筋接合部の形成を可能にすることです。最終的には、培養中のニューロンと筋肉細胞からの同時ペアパッチクランプ記録により、機能的なシナプス結合を実証できます。

この技術の優れた点は、容易にアクセス可能な脊椎動物のシナプス調製物が得られることです。シナプス後電気生理学的記録による神経伝達物質の放出をモニタリングすると同時に、シナプス前イオンの発生を測定するために使用できます。さらに、この方法は明確でわかりやすく、解剖顕微鏡以外の特別な機器を必要とせず、培養物を室温で簡単な培養培地に保存することができます。

この調製は、シナプス前、生化学的、および生物物理学的事象が神経伝達物質の放出とどのように結合するかなど、シナプス生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。さらに、それはまたの研究にも有用です 神経調節シナプス形成とシナプス可塑性 この手順を開始するには、添付の原稿に従って必要な溶液を準備します。次に、ガラス製パスティアピペットの端にミニューチンピンを接着することにより、少なくとも2つのマイクロ解剖ツールを製作します。

佐野アクリル接着剤で、ピンの鋭い端がピペットの端から約0.5センチメートル伸びるようにします。培養物を準備する2日前に、雌の目立つ赤みがかった爪のアイカと雄の前足の平面の暗い色素沈着を観察して、繁殖準備ができているXUSのペアを特定します。次に、各カエルをネットで囲み、腹側を下にしてネット付きのシンクに保持して、逃げられるようにします。

1ミリリットルのHCGをネットを通して、背側リンパ袋の1つに皮下注射して、動物が新しく産まれた受精卵を踏みにじらないようにします。タンクの底に1〜2インチを取り付けた半インチのメッシュサイズのスクリーンフロアを取り付けます。次に、繁殖ペアを蓋付きの10ガロンの水タンクに一緒に入れます。

受精卵が画面の下の床で観察されるまで、カエルを12〜48時間邪魔しておきます。次に、動物をタンクから取り出しますが、卵は少なくとも24時間以上邪魔されずに放置します。このカエルのペアは、6週間後に再交配することができます。

次に、タンクの底から胚をほぐし、生理食塩水を10%含む60×15mmの培養皿4つまたは5つに移します。新しいクーペのスキームに従って胚をステージごとに並べ替え、左のような明るい、茶色と白のモデリングで外観が滑らかなFaber胚が理想的です。一方、右側のように大きな黒または白の斑点がある胚は、一般的に不健康で使用できません。

層流フードの内側にラベルを付け、約半分の360 x 15 mmの滅菌培養皿に10%生理食塩水と1つのCMFを充填します。滅菌ガラスパスティエピペットを使用して、フード内のステレオズーム解剖顕微鏡の8つで10%生理食塩水を含む皿の1つに5〜10、ステージ22〜24の胚を移し、2対の滅菌鉗子を使用して各胚からゼリーコートとビエル膜を取り除きます。裸の胚を一度に1つずつ、残りの2つの生理食塩水の皿に通し、最後にCMFを含む皿に通して洗います。

次に、各胚を一対の鉗子で優しく、しかししっかりと保持し、マイクロ解剖ツールを使用して、動物の最も背側に位置する神経管と関連する筋節を切除します。これを行うには、神経管の位置の両端に1つ、神経管のすぐ腹側に3つのスライスを作成します。次に、解剖された各神経管筋節を、卵黄の顆粒やその他の破片から離れた皿のきれいな部分に移動します。

CMFで約15分後、鉗子を使用して色素沈着した皮膚を解剖した組織から持ち上げ、皮膚を廃棄します。さらに30〜60分後、細胞は互いに解離するため、砂の山を形成します。この手順では、10ミリリットルのチューブ状の培養液を解凍し、次に70マイクロリットルのITSを35ナノグラム/ミリリットルで解凍し、BDNF標識し、35ミリメートルの滅菌培養皿をL15培地でほぼ半分まで充填する。

解剖した胚ごとに1つの培養皿を使用してください。メッキピペットを製作するには、ガラス製のパスティエピペットの両端を持ち、テーパー部分を炎の上に置きます。次に、両端を約10センチメートル引き離します。

その後、先端を約0.2ミリメートルまで降伏させるために端を折る。その後、メッキピペットを使用して、1つの胚から積み上げられた砂を吸い込みます。溶液が吸引される量を最小限に抑えるように注意してください。

次に、細胞を培養皿の底に排出し、それらをいくつかのラインにプレートします。次に、メッキされた細胞の皿を少なくとも15分間邪魔されずに放置して、細胞が皿に付着する時間を確保します。培養で12〜24時間後、プレーティングされた細胞は明確な形態学的特性を発現します。

たとえば、筋肉細胞は紡錘形になり、脊髄ニューロンは長いプロセスを発達させます。尿酸、静脈瘤、筋細胞の間の機能的なシナプス接触は、同時ペアの電気生理学的記録で確認できます。そのためには、記録用の2つのパッチ電極を準備します(1つはシナプス前静脈瘤用、もう1つは筋細胞用です)。

次に、シナプス前電極にインフォテリン含有溶液を充填し、シナプス後電極にカリウム内部溶液を充填します。その後、培養皿内の培地をNFRに交換します。その後、フェイスコントラスト光学系を装着した倒立顕微鏡に移し、シナプス前静脈瘤をアムホテリシン含有電極で、シナプス後筋細胞を他方の電極でパッチしてシナプスの機能を確かめ、パッチクランプアンプで静脈瘤を脱分極させ、シナプス前電流とシナプス後電流を同時に観察します。

この図は、めっき直後の細胞と培養の5倍パワービューを示しており、これは同じ40倍での培養です。これは、ニューロンの体細胞、シナプス前、静脈瘤、およびシナプス後筋細胞を示す培養における神経筋接合部です。ここに示されているのは、シナプス前電流とシナプス後電流です。

マイナス30ミリボルトからプラス40ミリボルトまでのシナプス前静脈瘤に提示される10ミリボルトの増分電圧ステップの適用に応答して、両方の細胞の保持電位がマイナス70ミリボルトであったことを一度習得すると、この技術は約2時間で完了することができる。その後、生細胞培養は最短で24時間で取得でき、数日間維持することができます。この調製物はすでに何年も前から使用されており、神経筋伝達の基本的な特性のいくつかを説明するのに役立ちます。

このビデオが、研究者がこの強力でシンプルな手法に精通するのを助けることで、発見の継続を可能にすることを願っています。