子宮内電散法における両側性を用いたパイプラインによるげっ歯類の行動に対する遺伝的影響の調査

この方法を用いることで、特定の遺伝子発現の変化が神経疾患に関連する病状にどのように起因するかを発見することができます。この技術の利点は、作成と検証に何年もかかる可能性のある遺伝的動物系統を作成または購入する必要性を回避できることです。この技術により、神経疾患に関与する遺伝子の研究が可能になります。

特定の遺伝子が病理にどのように寄与しているかを決定することは、新しい治療法を開発するための重要なステップです。このプロトコルの利点は、実験者が生存率を低下させることなく遺伝子導入ステップを達成するように、胚を操作することを学習することです。胚は非常に壊れやすいため、この方法を視覚的に示しておくことは重要であり、経験豊富な実験者が処置中に胚をどのように操作するかを観察することは有益です。

手術の少なくとも30分前に、妊娠中の母親を手術エリアに持っていきます。滅菌した殺菌ワイプを使用して手術部位全体を滅菌し、次に70%エタノールを使用します。次に、オートクレーブツールをガラスビーズ滅菌器で滅菌します。

滅菌PBSを50ミリリットルの円錐管に移し、38〜40°Cに加熱した水浴にチューブを置きます。温度計で滅菌生理食塩水温度を確認してください。給湯循環ポンプをオンにして、摂氏37度に温めます。

次に、圧力インジェクターとエレクトロポレーターをオンにして、適切に機能していることを確認します。血漿DNA溶液を卓上遠心分離機で短時間遠心し、氷上に置きます。ピペットプーラーでガラスピペットを引っ張り、引っ張ったガラスピペットの先端が直径約50マイクロメートルになるようにします。

次に、ピペットに20〜40マイクロリットルのDNA溶液を入れます。脱毛ローション、ヨウ素、70%エタノール、綿棒、点眼薬、縫合糸、ガーゼなど、手術に必要なすべてのアイテムを設定します。手術シートを用意し、必要事項を記入します。

手術前にマウスの体重を測定し、体重を記録します。マウスに麻酔をかけた後、術前に鎮痛薬を投与し、脱毛クリームまたはカミソリを使用して腹部から毛皮を取り除きます。腹部をポビドンヨードと70%エタノールで3回綿棒で拭いて滅菌します。

腹部の周りに滅菌フィールドを作成し、滅菌ガーゼとドレープで。筋肉を切開しないように、鉗子で皮膚を持ち上げながら腹部の皮膚に正中線を切開します。次に、筋肉を持ち上げて切り抜き、重要な臓器を切らないように注意しながら切り抜きます。

環状鉗子を使用して子宮角をダムから慎重に引き出し、無菌フィールドにそっと置き、パッドで支えられ、ダムから離れすぎないようにします。手術の残りの部分では、温めた滅菌PBSを使用して子宮角を湿らせておきます。鉗子または指のいずれかで胚を配置し、引っ張ったガラスピペットを横方向の垂直に慎重に挿入し、ピペットを一方の心室に挿入し、次にもう一方の心室に挿入して、各心室に2〜3マイクロリットルを注入します。

心室は、注射後に三日月形が存在する場合、うまく標的化されています。前頭皮質で細胞を両側にトランスフェクションするには、2つの負極を胚の頭の側面に置き、側脳室に対してわずかに尾側に配置し、正極を発育中の鼻のすぐ前の目の間に配置します。胚がたっぷりと湿っていることを確認し、4つの正方形のパルスを適用します。

DNA溶液注入の直後に各胚がエレクトロポレーションされるように、すべての胚を1つずつ注入してエレクトロポレーションします。すべての胚がエレクトロポレーションされたら、子宮角を慎重に腹腔に戻します。腹腔内を滅菌PBSでコーティングして、子宮角の配置を助けます。

縫合が完了した後にエアポケットが残らないように、腹腔内に滅菌PBSを充填します。吸収性縫合糸で筋肉を縫合し、シルク非吸収性縫合糸で皮膚を縫合します。ダムが加熱されたチャンバーで少なくとも1時間完全に回復するのを待ちます。

今後48時間、定期的にダムをチェックしてください。ダムが麻酔から回復して意識を取り戻すと、動き始めて泡立て始めます。この方法は、約5, 000層2/3錐体ニューロンをpCAG-GFPプラスミドでトランスフェクションするために使用されました。

これらの細胞のほとんどは、前頭皮質領域に局在していました。代表的な例は、成体コントロールマウスにおけるトランスフェクションされたニューロンの吻側尾側分布を示しており、前頭皮質の錐体ニューロンの大きな集団を標的とし、遺伝的に標識する両側のIUEの能力を確認しています。母性相互作用課題の最初の部分では、制御されたP18トランスフェクトマウスが巣床を見つける能力をテストします。

対照マウスは、新しい寝床を探索するよりも巣床を探索する時間の方が長かったことから、感覚運動能力と探索行動が損なわれていないことが示唆された。タスクの2番目の部分は、マウスが母親と対話するように動機付けられる傾向を利用します。このタスクでは、子犬はほとんどの時間を母親の近くで過ごし、空のカップや巣の寝具を探索する時間が大幅に減少しました。

成体対照マウスは、新しい物体を探索する時間の約35%を費やしました。小説と身近な物体を提示されたとき、成体マウスは新しい物体を探索するのにより多くの時間を費やしました。社会性課題では、対照の成体マウスが同様の時間を費やして、新しいマウスと空のカップを探索しました。

この動作は、DeepLabCutソフトウェアを使用して、手足、重心、頭、耳など、マウス上のさまざまなポイントにラベルを付けることにより、自動的に追跡されました。また、マウスが後ずさりすると体の長さが短くなるため、マウスがいつ子育てをしていたかを判断するためにも使用されました。この手順に従うと、組織を検査し、スパイン密度やさまざまなタンパク質の発現レベルなどのさまざまな測定値をアッセイすることで、多くの細胞分子の質問に答えることができます。