分離と機能研究の好中球由来の微粒子のキャラクタリゼーション

このプロトコルの全体的な目標は、機能研究のために好中球由来の微粒子を分離し、特性評価することです。この方法は、がん、炎症、創傷治癒などのさまざまな生理学的プロセスにおける細胞間コミュニケーションにおける細胞間コミュニケーションにおける細胞外小胞(微粒子)の役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、比較的迅速で費用対効果が高いこと、および機能資産中の微粒子または微小小胞のp'henotypicic組成の評価を可能にすることです。

この手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるAriel Finkielszteinと、私の研究室の学部生であるJoseph Leeです。マウス骨髄多型細胞、またはPMN細胞の密度勾配分離のためには、まず、骨髄細胞サンプル1個あたり15ミリリットルの円錐管1本に、調製したばかりの室温溶液1.077グラム/ミリリットルの溶液を3ミリリットルの新たに調製した室温溶液1.119グラム/ミリリットルの密度溶液にゆっくりと重ね合わせます。次に、氷冷PBS中の新たに単離された骨髄細胞1ミリリットルを各チューブの上部密度勾配層に重ね合わせ、密度勾配遠心分離によって細胞を分離します。

分離の最後に、PBSと各チューブの上位密度勾配層との間の界面にある単核細胞層を、PMNバンドを乱さずに慎重に除去します。トランスファーピペットを使用して、PMN層をサンプルごとに1つの新しい15ミリリットルチューブに集め、0.1ミクロンの注ぎサイズのろ過されたPBSで各チューブの最終容量を最大15ミリリットルにします。遠心分離によりPMNをペレット化し、続いてチューブあたり2ミリリットルの新鮮にろ過されたPBSで2回目の遠心分離を行います。

次に、ペレットを1ミリリットルの新鮮なろ過済みPBSに再懸濁してカウントします。カウント後、細胞を再度遠心分離し、ペレットを0.1ミクロンの注ぎ口サイズのろ過済みHBSSの100マイクロリットルに再懸濁し、1,000万細胞あたりの目的の刺激剤を補充します。摂氏37度で20〜30分間インキュベートします。

刺激の最後に、遠心分離によって細胞を回収し、無細胞上清をサンプルごとに1つの新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。上清を遠心分離して細胞の破片を取り除き、透明化した上清を新しい超遠心チューブに移し、次に上清を超遠心分離し、ペレット化された微粒子をパラフィン密封超遠心チューブに80°Cで保存します。微粒子をマウスの結腸に投与するには、まず完全に麻酔をかけたマウスを腹臥位に置き、生検鉗子と高解像度カメラを備えた内視鏡を使用して、結腸の背側に沿って3〜5個の表在性創傷を生成します。

完全に回復するまでマウスをケージに戻します。24時間後、麻酔下で内視鏡を使用して、負わされた傷の画像を取得します。次に、大腸内視鏡検査ベースのマイクロインジェクションシステムを使用して、100マイクロリットルのHBSSに再懸濁されたPMN微粒子の実験量を各創傷部位に直接投与します。

PMN微粒子のサイズの不均一性は、微粒子を既知のサイズのフローサイトメトリービーズと比較することで評価できます。実証されたように、微粒子による目的のタンパク質の発現は、フローサイトメトリーによっても調べることができます。この実験では、活性化因子刺激PMN由来微粒子による主要な炎症分子および抗炎症分子の発現をイムノブロットによって評価しました。

上皮細胞の治癒に対するPMN微粒子の影響は、in vitroで事前に決定された時点での引っかき傷のある上皮単分子膜の画像取得、およびvivioでの生検鉗子創傷後の画像取得によって監視できます。一度習得すると、技術が適切に実施されれば、PMN由来の微粒子を4時間以内に分離できます。この手順を試みる際には、刺激の前にPMNを氷上に保持して、早期の活性化や微粒子の損失を防ぐ必要があることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、フローサイトメトリー、イムノブロッティング、およびリアルタイム増殖反応技術を使用して、さまざまな刺激条件下で、または起源の異なる細胞から微粒子含有量を定義することができます。この手法は、免疫応答の制御、バリア機能、組織の損傷と修復、およびがんの進行における微粒子の寄与の役割を調べるのに役立ちます。このビデオを見れば、マウスの微粒子を単離して標識する方法や、in vivoでの機能的な創傷治癒資産に微粒子を使用する方法について十分に理解できるはずです。

生きている動物を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行する前に、個人用保護具を着用し、適切な安全トレーニングを完了することを予防策として常に行う必要があることを忘れないでください。