ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

ピコリットルサイズの微小液滴に細胞を封入するアプリケーションでは、液滴あたりの細胞数を制御できないことがしばしば制限となってきました。本プロトコルでは、流体力学的な細胞の整列と、フローフォーカシング・マイクロノズルでの液滴生成という2つの異なるマイクロ流体現象を組み合わせることで、細胞封入を制御する方法を実証します。上流チャネルにおいて、細胞または粒子を懸濁させた水溶液を十分に高い流速で供給することにより、下流方向に向かって等間隔に並んだ列（トレイン）を形成させます。

フローフォーカシング液滴生成ノズルを用いて、界面活性剤で安定化された許容油キャリア流体中に、kHz単位の速度で水相液滴を形成します。次に、水相と油相の流速を調整して液滴生成を制御し、縦方向に整列した細胞または粒子が液滴生成ノズルに到達するタイミングと同期させた液滴生成速度を実現することで、整列した細胞粒子の列と液滴生成を組み合わせます。なお、ここでは粒子を細胞の代用として使用します。このプロトコルを実証するためには、流速を十分に低く設定し、流体を制限する必要があります。

生物学的細胞へのせん断応力、細胞配列の重複、液滴生成、および細胞生存能について検討します。水相の流れ速度の制約により、単一および複数の細胞を制御してカプセル化するための理想的な動作領域が提供されます。ビデオ顕微鏡データの解析により、単一および二重の細胞または粒子のカプセル化効率は、ランダムなカプセル化効率を上回り、目的の数の細胞または粒子を含まない液滴の数を大幅に減少させることが示されました。

細胞や液滴を閉じ込めることで、細胞分泌物の希釈を抑制し、細胞の不均一性を明確にするとともに、バルク懸濁液と比較して細胞間シグナルを制御することが可能になります。これらの細胞を液滴内に効率的に封入する手法は、生物学研究者にとって有用なツールとなります。本手順を開始するために、AutoCADソフトウェアを用いて、この図に示すようなマイクロチャネルパターンを設計してください。

長いチャンネル部分は、幅 27 µm の水相フロー整列チャンネルを表しています。拡大したノズルの概略図では、水相整列チャンネルとオイルチャンネルの幅がともに 27 µm であり、それに続いて 22 µm のノズル収縮部があり、その後 61 µm のより広いチャンネルへと急拡大しています。デバイスの高さは 52 µm です。

水相および油相の両方の入口には、この油相入口の拡大模式図に示されているように、 ordering channel の幅と同程度のギャップを持つ大きなデブリフィルターが備わっています。ここでは、色素を注入した ordering channel とノズルの実像を示します。チャネル部分が暗い背景の中で透明になるように、マイラーフィルムまたは石英に高解像度の透過マスクを印刷し、外部メーカーに委託してください。

続いて、レプリカ成形用のシリコンおよびSU-8フォトレジストマスターを作成します。PDMSレプリカ成形のため、マスターモールドをペトリ皿の底にテープで固定します。レプリカ成形が完了し、デバイスの外形を切り出した後、外径0.75 millimeterのバイオプシーパンチを使用して、図に示す3つの円形領域に流体ポートを開けます。プラズマ接合後、PDMSのパターン側にスコッチテープを貼り、剥がしてほこりを除去します。

PDMSを洗浄済みのガラス顕微鏡スライドに貼り付けます。デバイス全体をオーブンに入れ、徐々に120 °Cまで加熱します。ボンディングを完了させ、PDMSを元の疎水状態に戻すため、デバイスを120 °Cのオーブン内に一晩放置します。

チャネルのガラス表面を疎水化するための代替法として、Aquapelなどのコーティング剤を流体ポートに注入し、その後空気でパージする方法があります。1 mLシリンジとシリンジ針を用い、数百 µLの空気を吸引し、続いて金属製のシリンジチップを満たす程度の少量のAquapelを吸引します。慎重に、かつ確実にAquapelを注入し、続けてパージ用の空気を流体ポートに注入してください。この際、PDMSとガラスの接合部を激しく破壊しないように注意してください。

乾燥時にチャネルを詰まらせる可能性のある沈殿物を避けるため、余分な水を拭き取りながら、すべての流入ポートおよび流出ポートでエアパージを繰り返します。適切なドロップ数に対して適切な細胞数を確保するためには、細胞濃度の制御が不可欠です。これには、困難な2つの要素があります。

1つ目は事前に適正な濃度を推定することであり、2つ目は実験中にその濃度を維持することです。本研究で使用した特定の装置では、制御された封入を行うために、細胞または粒子は8～15 µmである必要があります。このデモンストレーションでは、細胞の代用として9.9 µmのポリ（スチレン）ダイアリ・マイクロクロスフィアを使用します。理想的な単一封入を実現するための水性粒子懸濁液濃度を調製するには、完全な封入に関する過去のデータに基づき、マイクロクロスフィアのストック濃度を重量比1%固形分として開始します。目安として、ストックサンプル1 mLを緩やかに遠心分離し、上清液250 µLを除去した後、ボルテックスミキサーまたはより緩やかな混合で粒子を再懸濁させることで、濃度を1.5%固形分まで上昇させます。

このビデオでは示していませんが、細胞を使用する場合、細胞とポリスチレン粒子の両方の比重は1より大きくなります。数分から数時間というオーダーの長期的な実験を行う場合は、粒子には塩化カルシウム、細胞にはOptiPrepなどの溶質を添加して、溶液の浮力を調整してください。細胞または粒子の懸濁液が準備できたら、15 mL centrifuge tubeに10 mLの連続相フルオロカーボンオイル試料を用意し、ボルテックスしてください。

界面活性剤とフルオロカーボンオイルを、重量比で約2.5%になるように混合します。ここでは重量比2.4%の混合物を得ましたが、マイクロカプセル化実験のセットアップにおいて許容範囲内です。まず、倒立光学顕微鏡と高速カメラの電源を入れます。

マイクロチャネル層に焦点を合わせ、チャネル内に詰まりや、剥離して流出する可能性のある不純物がないか確認します。大きな不純物や明らかな詰まりのないチャネルを選択してください。死容量を最小限に抑えるため、水相入口、油相入口、およびエマルジョン出口用に、半透明のTigon PVCチューブを3本、適切な長さに切断します。

シリンジポンプから顕微鏡まで届く長さのチューブを切断します。流体ポートへの挿入を容易にするため、チューブの端を45度の角度にカットしてください。ピンセットを使用して、チューブ端を流体ポートに押し込みます。次に、水性液導入チューブの自由端に、30ゲージの鈍針ステンレス製シリンジ針を押し込んで固定します。

オイル入口チューブについても同様に繰り返します。装置を移動させ、チューブを顕微鏡ステージに取り付け、20倍の対物レンズを使用してデバイスのノズルに合わせて調整し、フォーカスを合わせます。顕微鏡を手動で調整してケーラー照明を行い、焦点面で最適な照明が得られるようにします。

高速カメラのソフトウェアを使用して、フレームレートを高く設定できるようノズルの周囲の視野をクロップし、その後、最適な記録に必要なフレームレート、露光時間、およびその他のカメラ設定を行います。次に、あらかじめ調製し十分に混合した水相溶液を1 mLのシリンジに充填します。また、油相溶液を3 mLのシリンジに充填します。

充填したシリンジの1本を垂直に傾け、軽く叩いて気泡をシリンジの出口へ移動させます。シリンジを垂直に保持したまま、プランジャーをゆっくりと押し下げ、空気がシリンジの先端に押し出されるまで操作します。その後、シリンジをデバイスに装着済みの対応するシリンジ針に接続します。

プランジャーを押し下げ、シリンジ針のデッドボリューム分だけ空気を押し出し、液体がチューブを通ってデバイスの直前まで到達するようにします。シリンジをシリンジポンプにしっかりと固定し、プランジャーブロックを掛けます。2本目のシリンジについても同様に接続し、2台目のシリンジポンプに固定します。各シリンジポンプの電源を入れ、設定を行います。製造元のプロトコルに従い、初期流量を油相で50 µL/min、水相で5 µL/minに設定します。

水相の開始にあたり、ポンプは各液体がデバイスに導入され、チャネル内を満たして残りの気泡を押し出すまで待機します。初期流速を使用する場合、これには数分かかることがあります。ノズルでの液滴の形成を確認してください。

水相の流速をゆっくりと上げ、長い水溶液チャネル内での粒子の整列を観察します。流速を上げる際は、この例（異なる液滴生成ノズルを使用）に示されているように、ノズルで水相流のジェット現象が誘発される点まで流速を上げないでください。不安定な流れと不均一な液滴が発生している点に注意してください。粒子濃度が低すぎて、欠損粒子が比較的少ない交互の列が得られない場合で、かつサンプルの浮力が調整されていない場合は、シリンジポンプをシリンジ出口方向に物理的に傾け、粒子がシリンジ出口に向かって徐々に沈降するようにしてください。

適切な整列が確認されたら、オイル流速を調整して、液滴の生成頻度とサイズを微調整します。目的のカプセル化率と液滴容量を達成するために、両方の流速を繰り返し調整してください。安定した整列カプセル化が確認されたら、流出チューブを廃棄リザーバーから回収リザーバーへ移動させ、後の使用に備えます。

単一粒子または細胞、および二重粒子の封入を高効率で実現できます。本プロトコルを用いた代表的な結果として、オイル流速 60 µL/min、水相流速 9 µL/min での単一粒子封入を示します。液滴あたりの平均粒子数である Lambda は 0.95 です。

完全に規則的に交互に配列した粒子の流路方向の間隔は約 17 〜 18 µm です。この例における液滴生成速度は 6.1 kHz であり、平均液滴サイズは 24.4 pL です。このヒストグラムは、単一粒子のカプセル化とそれ以上の粒子をカプセル化した場合の液滴への粒子封入効率を比較したものです。

統計的に、サンプルサイズ517液滴におけるランダム封入では、1つの粒子を含む液滴の平均分率は79.5%であり、予測されるランダム封入分率の36.7%とは対照的な結果となりました。サンプルサイズ491粒子のとき、正しく封入された液滴に含まれる粒子の分率は83.7%であったのに対し、ランダム封入分率は37.3%でした。水相の流量を9 µL/minに維持したまま、油相の流量を30 µL/minに下げるだけで、2粒子封入が達成されます。ここでのlambda（液滴あたりの平均粒子数）は1.8であり、単一粒子封入と同様です。

完全に規則的に交互に配列した粒子の場合、流れ方向の粒子間隔は約17から18 µmです。大きな液滴の平均サイズは39.8 pLであり、ランダム封入と比較して3.8 kHzの速度で生成されました。383個の液滴のサンプルサイズにおいて、2つの粒子を含む規則的封入液滴の平均割合は71.5%であり、予測されるランダム封入の割合である26.8%とは対照的でした。689個の粒子のサンプルサイズにおいて、正しく封入された液滴に含まれた粒子の割合は79.5%であることが観察されましたが、ランダム封入の割合は33.4%でした。

以上の結果から、単一粒子および二重粒子の封入効率は、いずれもランダム封入効率を2倍以上上回り、目的の細胞数や粒子数を含まないドロップの数を大幅に減少させることが示されました。高い封入効率を得るために適切な粒子または細胞濃度が重要であることが、この実験ランで示されています。オイルと水相の流速は前述の二重粒子封入ランと同じですが、ドロップあたりの平均細胞数 lambda は1.57に減少しています。

その結果、完全な規則正しさは得られず、トレインの中に空隙が生じ、想定よりも粒子数が少ないサン・ドロップが現れます。このヒストグラムは、Lambdaの値が低いために、2つの粒子の封入効率が低下していることを示しています。324個のドロップのサンプルにおいて、2つの粒子を含むドロップの平均割合は55.9%であり、単一粒子のドロップがほぼ2粒子ドロップと同数存在していました。

これは、選択した$\lambda$の値に基づき、1ドロップあたりの許容細胞数が少ないか多いかに応じて、正しく封入された粒子または細胞を最大化するためには、$\lambda$を1ドロップあたりの目標細胞数と同等またはそれに近い値にするべきであることを示しています。本デモンストレーションでは、浮力の不一致を利用して、実験中の濃度をリアルタイムで制御しています。しかし、より長期的な実験においては、細胞を水相ドロップに封入した後の結果をより安定させるために、浮力を一致させることが推奨されます。

時間依存的な実験は、遠心管内で行うか、あるいは液滴をマイクロ流体アレイに再注入して顕微鏡下で観察することによって実施できます。