ペプチド第三級アミドライブラリのスプリット·アンド·プールの合成とキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、ペプチドターシャリーアミドまたはPTAユニットを含むコンビナトリアルライブラリーを合成する方法を実証することです。これは、最初に天然アミノ酸からPTAサブモノマーを調製することによって達成されます。第2のステップは、固体支持体上にペプチドリンカー領域を合成することです。

次に、PTAとペプチドサブユニットを含むコンビナトリアルライブラリーを合成します。最後のステップは、合成の品質を確保するために、合成されたライブラリを特性評価することです。最終的には、確認可能な制限付きPTAサブユニットを含むコンビナトリアルライブラリーが合成され、そのようなライブラリーをハイスループットスクリーニングに使用してタンパク質リガンドを提供し、新薬の発見につながる可能性があります。

したがって、この記事の主題である化学は、以前に取り組んだペプチドやその他のものよりもはるかに硬い分子を見つけようとする試みで開発されました。この考え方は、より硬い分子のライブラリーを特定すれば、それらがはるかに高い親和性でタンパク質標的に結合するというもので、これは、前進する薬や興味深いプローブ分子を開発する上で非常に重要であると考えました。このPTAサブオーダー合成の視覚的なデモンストレーションは、温度とタイミング制御が合成を成功させるために非常に重要であるため、合成を学ぶのが難しいため

まず、8.9グラムの食事と11.9グラムの臭化カリウムを、マグネティックスターバー付きの500ミリリットルの3ネック丸底フラスコに加えます。次に、事前に調製した30%臭化水素溶液100ミリリットルをフラスコに加えます。フラスコをマイナス10°Cのエチレングリコールに入れた後、フラスコの底から長い針を通してドライアイスバスバブルアルゴンを10分間浴します。

マグネチックスターバーで溶液を300RPMで攪拌しました。これに続いて、事前に調製した亜硝酸ナトリウム溶液を、3つのネック、丸底フラスコに取り付けられた圧力均等化滴下漏斗に追加し、セプタムで密封します。滴下漏斗のバルブをゆっくりと開き、亜硝酸ナトリウム溶液がフラスコに滴下できるようにします。

バルブを制御して、滴下速度を毎秒約2滴に調整します。亜硝酸ナトリウムの添加が完了したら、溶液をさらに3時間攪拌し続け、温度がマイナス10°Cから室温まで温まるようにします。溶液の色が暗すぎる場合は、真空を適用して、反応中に発生する可能性のある過剰な窒素酸化物と臭素を除去します。

溶液が抽出漏斗に移されたら、35ミリリットルのダチルエーテルで製品を3回抽出します。有機相を混合し、飽和塩水で洗浄した後、フラスコに集め、硫酸ナトリウムで6時間乾燥させます。硫酸ナトリウムをろ過した後、溶媒を真空下で蒸発させて、透明から淡黄色の油を生成します。

同位体標識のために3対1のヘキサンエチルアセテートを含むシリカゲルカラムクロマトグラフィーで粗生成物を精製し、50ミリリットルのポリエチレンチューブに300ミリグラムのLアラニンと10ミリリットルの重水素化水を溶解します。cos基質として10ミリグラムのαケトグルタル酸を加えた後、チューブを摂氏37度に温めます。終了したら、1モルの二酸化ナトリウム溶液とpHテストストリップを使用してpHを8.5〜8.7に調整します。

次に、0.1ミリグラムのアラニントランスアミナーゼを溶液に加えます。チューブを摂氏37度のインキュベーターに入れ、10〜30 RPMで軽く振とうしながら一晩インキュベートします。この時点で、1グラムの90ミクロン、10をラムリンカーでゲルビーズに10ミリリットルのジメチルホルムアミドで3時間、12ミリリットルのシリンジリアクターで穏やかに振とうしながら、ジメチルホルムアミドをリアクターから排出し、10ミリリットルの20%piペリンジメチルホルムアミド溶液を追加して、リンカーの中でリンクからFOCグループを保護します。

ビーズを20%ペパーダイン溶液で30分間振とうした後、ジメチルホルマミートで5回洗い、ペパーダインをすべて取り除きます。次に、シリンジからいくつかのビーズを取り出し、クロラールテストでテストします。2ミリリットルの2モルブロモ酢酸ジメチルホルムアミド溶液をビーズに加え、穏やかに振とうします。

次に、2ミリリットルの2ミリリットルの2モルジオッププロピルカルボジアミンジメチルホルムアミド溶液をビーズに加えます。シリンジをプランジャーで密封した後、シェーカーでビーズを10分間振ってください。ビーズをジメチルホルムアミドで十分に洗浄したら、事前に調製した1モルのメトキシエチルジメチルホルムアミド溶液を2ミリリットル加えます。

ビーズを振盪し、ジメチルホルムアミドで5回洗浄した後、いくつかのビーズをクロラールテストで確認します。これに続いて、前に使用したシリンジに10ミリリットルの1対1のジクロラールメタンジメチルホルムアミド溶液を追加します。1000マイクロリットルのピペットと切り捨てられたピペットチップを使用して、すべての1グラムのビーズを3つの5ミリリットルシリンジリアクターに均等に分割します。

3 つのシリンジをクロロ メタンで 3 回洗浄した後、r および s 標識シリンジを無水テット ハイドロ フューリンで 3 回洗浄し、B 標識シリンジをジメチルホルムアミドで 3 回洗浄します。ブロモプロパンNOIC酸のトリスチンカップリングには、ヒュームフード内のバイアルに約200ミリグラムのトリスチンを加えます。バイアルに蓋をしたら、バイアル内のトリスチンの量を量ります。.

次に、適切な量の無水テトラ ハイドロ フェランをバイアルに加えて、ミリリットルあたり 20 ミリグラムの Tri ホスゲン テトラ ハイドロ フェラン溶液を作ります。ブロモ酸トリホスゲン混合物を調製するには、89マイクロリットルのR 2ブロモプロパンNOIC酸とS 2ブロモプロパンNOIC酸D 4を2つの小さなバイアルに別々に加え、トリスチンテトラハイドロフラン溶液の5ミリリットルを追加します。バイアルを密封した後、マイナス20°Cの冷凍庫に20分間置きます。

その間に、シリンジrとs.別々に、冷却されたブロモ酸ホスゲン混合物を含むバイアルのそれぞれに2 4 6トリメチルプリンの356マイクロリットルの2 4 6トリメチルプリンの1、125マイクロリットルを追加します白い沈殿物を生成します。すぐに対応する懸濁液をified ビーズに直接適用し、シェーカーに置き、120 RPM未満で2時間振とうします。

ジイソプロピルカルボジアミンとブロモ酢酸カップリングのために、シリンジB.振とうした後、同じシリンジに2モルのジプロピルカルボジアミンジメチルホルムアミド溶液の5ミリリットルを追加し、シリンジrおよびsと同じシェーカーでこの場所のシリンジBに続いて穏やかに振とうします。次に、シリンジをジクロロメタンとジメチルホルムアミドで完全に洗浄した後、シリンジを2時間振とうします。シリンジR、s、Bからのすべてのビーズを1つの12ミリリットルシリンジリアクターにプールします。

ビーズをジメチルホルムアミドで5回洗浄したら、10ミリリットルの1対1のジクロロメタンジメチルホルムアミド溶液をシリンジに加えます。1000マイクロリットルのピペットとエマネーション用の切り捨てられたピペットチップを使用して、すべてのビーズを7つの個別の2ミリリットルシリンジに均等に分割し、対応するシリンジに7つの前に調製した2モルアミン溶液の5ミリリットルを追加します。7つのシリンジすべてを摂氏60度のインキュベーターでインキュベートし、インキュベーション後一晩振とうします。

切断が必要なビーズをジクロラールメタンで5回洗浄します。ビーズを15分間振とうし、再度ジクロロメタンで洗浄した後、シリンジからジクロロメタンを排出します。次に、個々のビーズを96ウェルプレートに移します。

光学顕微鏡と先端が切り捨てられたピペットを使用して、96ウェルプレートをカバースリップで覆い、マイナス20°Cの冷凍庫に15分間置きます。プレートを冷凍庫から取り出したら、事前に調製した冷却された1対1のTFA DIクロロメタン溶液を20マイクロリットルを、ビーズを含む各ウェルに追加します。カバースリップを元に戻し、96ウォールプレートをマイナス20°Cの冷凍庫のシェーカーの後ろに置きます。

20分間振った後、96ウォールプレートを冷凍庫から取り出し、カバースリップをはがします。各井戸からジクロロメタンを空気を吹き付けてブロードライします。50%TFA DI CHLOROメタン溶液を使用して室温で切断すると、著しい分解が観察されます。

ピーク593およびピーク484は、それぞれリンカーおよびPTA三量体に対応しており、全分子がビーズ上で成功裏に合成されたが、切断中に分解されたことを示している。上記のような低温条件下で切断すると、TFAによる劣化量が大幅に抑制されます。この切断メカニズムは以前の文献に記載されており、オレイン中間体PTA分子を経由すると考えられており、Ms.MS によって配列決定でき、フラグメンテーションパターンはペプチドやペプチドと似ています。

S、2、ブロモ、プロポール酸、D、4で合成されたPTA分子は、一般にMSおよびmsmでより広いピークを示します。Ms.Spectra S 2ブロモプロパン、NOIC酸D 3などの不完全な持続時間生成物が存在するため、これはシーケンシング手順中にR Chiral中心の存在を示すものとして使用でき、PTA分子はペプチドペプチドよりも付加物を形成する傾向があります。したがって、低ナトリウム水とプラスチック装置が好ましい。

また、アミノ化時の臭素の除去から形成されるアクリルアミドも副産物となり得るものです。アクリルアミドが形成されると、配列は終了します。これは、溶液を減らすために第一級アミン濃度を1モルに下げることで解決できます。

基本性 適切なサイズのライブラリをマスターすると、適切に実行されれば2日で準備できます。この化学が完全に開発され、合成が非常に効果的になった今、他の研究者がこの強力な技術を採用して、医薬品開発やプローブ開発のためのコンフォメーション制約ペプチド模倣物を作成することを願っています。