リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

次の実験の全体的な目標は、無料で入手できるソフトウェアツールボックスであるLCGを使用して、皮質ニューロンでin vitroダイナミッククランプを実行することです。これは、パラメタル細胞からのパッチクランプ記録のためにラット体性感覚皮質のスライスを調製することによって達成されます。第2のステップとして、一連の自動化された電気生理学的プロトコルを記録された細胞に適用し、細胞の標準的な特性評価を提供し、その後の細胞タイプ間の分析および比較に役立ちます。

次に、興奮性および抑制性シナプスイベントの注入をシミュレートします。新皮質ニューロンが経験する高伝導状態をin vivoで再現するために、結果はバックグラウンドシナプス注射が皮質細胞の利得をどのように調節するかを示しています。この手法が既存の方法よりも優れている主な点は、例えば、ある実験プロトコルの結果を別のプロトコルへの入力として使用することで、実験記録をより複雑なワークフローに組み込むことができることです。

この方法は、電気生理学的プロトコルの標準化、データ解析の迅速化、ラボ間でのデータ共有への道を開くのに役立ちます。この方法はもともとin vitroでのホールセールパッチCLA記録用に開発されましたが、in vivoパッチ、CLA記録、またはマイクロtoアレイレースによる加速記録など、他の実験準備やプロトコルにも便利に使用できます。ラットの脳を抽出した後、小脳を捨て、メスを使用して正中線に沿って2つの半球を分離し、半球の1つから余分な液体を取り除き、傾斜したプラットフォームに瞬間接着剤を一滴垂らして接着します。

次に、脳の上にCSFを数滴すばやく追加し、ビブラムチャンバーに移します。脳組織の最初の2.5〜3ミリメートルをブレードで取り除きます。その後、スライス表面の損傷を制限するために、スライス速度と周波数を調整します。

次に、厚さを300マイクロメートルに設定してスライスを開始します。刃が皮質を通過したら、かみそりの刃または曲げた針を使用して、海馬の上と関心のある皮質領域の端に切り込みを入れます。その後、スライスを摂氏36度のマルチウェルインキュベーションチャンバーに移します。

この手順では、40倍倍レンズを使用して記録チャンバーにスライスを置きます。第5層と600〜1000マイクロメートルの範囲で健康な細胞を検索します。脳表面より下では、これらの細胞は通常、コントラストが低く、滑らかな外観を持ち、腫れていません。

健康な細胞が見つかったら、マイクロピペットの3分の1に細胞内溶液をロードします。次に、事前構成されたLinuxオペレーティングシステムのヘッドステージに配置します。コマンドを起動します。

シェルはプロンプトを追加します。このコマンドを入力して、データ・アクイジション・ボードがアンプを駆動していないことを確認します。次に、ピペットホルダーに接続されているシリンジのピストンを押して、30〜50ミリバールの正圧を加えます。

次に、ピペットをスライスの約100マイクロメートル上に置き、マイクロマニピュレータのアプローチモードを使用してピペットをターゲットセルに向かって動かします。その後、電気生理学アンプのピペットオフセットを調整し、電圧クランプモードで10ミリボルトのテストパルスを出力します。コマンドLCG SEALテストを使用してピペットの抵抗を監視し、シリンジのピストンを引き抜いて圧力を10〜30ミリバールに下げます。

細胞にそっと近づき、ビデオカメラのモニターで画像を観察して、くぼみの形成を確認します。同時に、テストパルスによって誘発される抵抗の増加を、モニタに表示される電流波形を見てモニタします。ピペットの抵抗が増加し、細胞にくぼみが形成された場合は、すぐに圧力を解放し、ピペットに穏やかな負圧を加えてシールの形成を助けます。

その間に、保持電位を徐々にマイナス70ミリボルトに下げます。穏やかに吸引して細胞膜を破裂させ、細胞全体の構成を確立します。次に、その電気的特性の観点からセルを特徴付けます。

コマンド LCGE code を使用します。これは、閾値が負の50.5ミリボルトのパッチされた第5層パラメタルニューロンの平均活動電位です。この図は、過分極電流に対する受動的応答の測定を示しています。

細胞の基本的な活性特性の同定は、細胞が規則的なスパイクニューロンであり、シェルのコマンドプロンプトでこのコマンドを入力することにより、次の実験が保存されるディレクトリにシミュレートされた興奮性、シナプス後電位の変化を注入するための最小限の適応があることを明らかにします。従来のハードウェアによるアンプ制御に頼らずに。ブリッジ バランシングとキャパシタンス コンペンセーションを適用するには、このコマンドを発行してアクティブ電極 compensation を実行するために必要な電極カーネルを見積もります。

フルカーネルは、高速の電極カーネルと、フルカーネルで観察される指数関数的なテールを生じさせる低速の膜カーネルの2つのコンポーネントの合計です。前者はピペットのノンパラメトリックモデルを構成する 膜と電極のカーネルを分離するための電流注入時に、LCGカーネルコマンドは、高速電極カーネルを構成するポイントの数をユーザーに促します。次に、電極カーネルが指数関数的減衰テールの端を覆うように数値を選択します。

次に、このコマンドを使用して動的クランプ実験を実行します。最後に、結果を視覚化します。ダイナミッククランプを用いた生体様活性の再現です。

赤と青のトレースは、それぞれ興奮性シナプスと抑制性シナプスのシミュレーションを表しています。そして、これは、興奮性または抑制性のシナプス後電流の衝撃を受けたL5パラメタルニューロンから記録された電圧トレースです。細胞に注入された対応する興奮性、抑制性、および全電流がチャートに示されています。

20回の試行で生成されたスパイクのラスタープロットは、ニューロンが同じ入力に対して非常に信頼性が高く、正確であることを示しています。このビデオを見れば、無料で入手できるソフトウェアツールボックスを使用して動的ランプ実験を行う方法について十分に理解できるはずです。LCGです。この手順は、他の閉ループプロトコルに拡張して、神経興奮性から複雑なネットワーク相互作用に至るまで、さまざまなテーマを調査することができます。