動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

この手順の全体的な目標は、バイオレイヤー干渉法を使用して異なるpH環境下でのタンパク質複合体の動的集合を観察し、電子顕微鏡と質量分析法を使用して成分を確認することです。タンパク質複合体の形成と集合を支配する特異性を特定し、理解することは、生化学研究者にとって非常に興味深いことです。今日お話しする方法論により、研究者は予測された高分子複合体を組み立て、視覚化し、検証することができます。

バイオセンサー表面の複雑な性質により、研究者は組み立てた複合体を電子顕微鏡や質量分析のために小さな微量に容易に放出することができます。このデモンストレーションでは、炭疽菌毒素複合体のpHによる構造転位の速度論を追跡し、凝集を避けながら、電子顕微鏡法と質量分析法によってこれらの再配列を検証しました。BLIバイオセンサー表面での炭疽菌毒素の集合体、マクロサンプルの放出、およびEM陰性染色手順をデモンストレーションするのは、私の研究室の大学院生であるAlexandra MachenとPierce O'Neilです。

Dr.Antonio Artiguesは、Orbitrap Fusion Lumos質量分析計を使用して、BLIで放出された微量サンプルの分析と同定に尽力しています。まず、アミン反応性第2世代BLIバイオセンサーチップを250マイクロリットルの水に浸して水和させ、10分間インキュベートします。Blitzソフトウェアで、この表に記載されているステップ時間をプログラムします。

バイオセンサーの先端を250マイクロリットルの水に30秒間浸してBLIの実行を開始し、バイオセンサーの厚さと密度の初期ベースラインを測定します。次に、チップを250ミリリットルの50ミリモルNHSと200ミリモルEDCに7分間浸漬してバイオセンサーを作動させます。次に、活性化されたバイオセンサーを、0.1モルのホウ酸緩衝液(pH 8.5)に溶解した50ミリモルPDEAに5分間浸漬して、活性化された生体反応性表面を生成します。

次に、活性化された生体反応性バイオセンサーを、100ナノモルのE126C LFnを含む溶液の250マイクロリットルに浸し、10ミリモルの酢酸ナトリウムpH 5、100ミリモルの塩化ナトリウム緩衝液に5分間浸します。LFnチップを50ミリモルのL-システイン、1モルの塩化ナトリウム、0.1モルの酢酸ナトリウムpH 5に4分間浸漬し、残っている遊離チオール反応性基をクエンチします。急冷したLFnチップを50ミリモルトリス、50ミリモル塩化ナトリウムに浸してバッファーベースラインを確立した後、チップを0.5マイクロモルの保護抗原プレポア、50ミリモルトリス、50ミリモル塩化ナトリウムに5分間浸してLFn PA−プレポア複合体を作製する。

PAプレポアが結合したら、PAプレポア溶液からチップを取り出し、チップを50ミリモルのトリス、50ミリモルの塩化ナトリウムに30秒間浸して、非特異的に結合したPAプレポアを洗い流します。LFn PA-prepore複合体を50ミリモルトリス、50ミリモル塩化ナトリウム中の0.5マイクロモルCMG2に5分間浸漬します。LFn PA-prepore CMG2複合体を50ミリモルのトリス、50ミリモルの塩化ナトリウムに30秒間浸漬し、結合していないCMG2を洗い流してプレエンドソーム複合体を形成します。

EM解析では、50ミリモルDTT、50ミリモルトリス、50ミリモル塩化ナトリウムの5マイクロリットルを含むPCRチューブにチップを浸漬することにより、LFn PA-prepore CMG2複合体をバイオセンサーチップから放出します。複合体からのペプチドのタンデムMS分析では、50ミリモルDTT、6モルケラチンフリー塩酸グアニジン、およびpH8の25ミリモル重炭酸アンモニウムを含むPCRチューブにバイオセンサーを浸漬することにより、バイオセンサーチップからLFn PA-prepore CMG2複合体を放出します。pH移行後の複合体を見るには、先ほど示したように、LFn PA-prepore CMG2複合体をバイオセンサー上に組み立てます。

バイオセンサーチップを10ミリモルの酢酸pHに5分間浸漬し、PAプレポアからPAポアへの移行を開始します。この遷移は、振幅の増加とそれに続くより大きな振幅の減少によって示され、これは結合親和性の低下による完全な受容体解離にとってかなり大きいと仮定されています。EM解析では、バイオセンサーチップを1.25ミリモルミセルを含む溶液に5分間浸漬し、ジスルフィド放出後の溶液中の凝集を防ぎます。

ネガティブステイン電子顕微鏡法を実施するには、まずカーボンコーティングされた銅300グリッドを0.38ミリバールの安定気圧とマイナス15ミリアンペアで20秒間グロー放電し、次にデバイスを空気で排出します。きれいなピンセットの間にグリッドを固定します。次に、放出された複雑なサンプルの4マイクロリットルをグリッドにピペットで移動し、60秒間吸着させます。

濾紙のくさびで、残りの液体を吸い取ります。次に、0.75%ポイントゼロ2ミクロンのろ過されたギ酸ウラニルを5マイクロリットルピペットでグリッドにピペットで移し、5秒後に余分な汚れを吸い取ります。グリッドを覆った状態で室温で乾かします。

次に、透過型電子顕微鏡を使用してサンプルを観察します。最後に、テキストプロトコルに従って質量分析用のサンプルを調製した後、CIDと正規化された衝突エネルギー35を使用して質量分析計を自動制御で操作し、1回のMSスキャンを連続して実行し、その後、3秒間でできるだけ多くのタンデムMS-MSスキャンを実行します。BLIセンソグラムトレースは、炭疽菌毒素成分の特定の添加による振幅変化をリアルタイムで読み出します。

最初のライズは、先端にLFnをロードすることです。クエンチングおよびベースライン化後、PA-プレポアはLFnに結合し、続いて可溶性CMG2を添加して、組み立てられたプレエンドソーム複合体を調製する。次に、複合体は低pHにさらされ、受容体結合が弱まり、ミセルの添加によって確認される拡張細孔の確認にプレポアが移行します。

ここに示されているのは、バイオセンサーから放出された複合体のネガティブ染色EM画像です。プレエンドソームサンプルグリッドは、LFn PA-prepore CMG2からなるインタクトな三元複合体と一致する密度を示しました。酸性化後の錯体グリッドは、PAが細孔に遷移し、明らかなCMG2密度なしにミセル包有物によって可溶化されることを示しています。

タンパク質複合体を確認したMSからわかるように、プレエンドソームMSサンプルには、LFn、PA、CMG2のカバー率がそれぞれ60.46、67.97、54.15%の3つの毒素成分すべてからのペプチドが含まれていました。ポストエンドソームサンプルには、LFnおよびPA由来のペプチドのみが含まれていました。CMG2の欠如は、細孔形成中に観察されたBLIナノメートルの減少と一致しています。大きな高分子複合体の集合体をモニターし、検証する能力は、大きな生体分子集合体の特異性と機能を理解するための重要なステップです。

バイオセンサーから事前に組み立てられた高分子複合体をマイクロボリュームに放出して電子顕微鏡で可視化する能力は、構造解析に非常に役立ちます。バイオセンサー集合体組成の解析では、放出複合体の0.04フェムトモルのみを使用して、同化エンドソーム酸性化の前後の成分を特定しました。バイオセンサーアセンブリリリースプロトコルは、ウイルスタンパク質構造内の他の細菌毒素の自然でありながらとらえどころのないpH誘発性エンドソーム遷移に従うように適合させることができ、タンパク質凝集を回避するという追加のボーナスがあります。