タップのタグを使用して葉緑体トランスロコン タンパク質複合体の親和性の浄化
2018年11月1日
我々 はここで葉緑体の浄化のためのテスト/実証済みのプロトコル タンパク質インポート複合体 (TIC TOC 複合体) をタップ-タグを使用してを提示.ワンステップの親和性隔離のプロトコルは蛋白質を適用できる可能性があると質量分析法による新しい相互作用のパートナーを識別するために使用します。
この方法は、葉葉芽細胞の分野で重要な質問に答えるのに役立ちます, 例えば, 葉葉芽細胞のインポート機械の組成.これは、緑化と光合成のために不可欠であり、したがって、地球上の食糧生産のために不可欠です。分子機械は、TOCとTICと呼ばれる葉ロプラスの外側と内側のメンバーの2つの別々の複合体で構成されていますが、組成は完全には知られていません。
この技術の主な利点は、シロイヌナズナシスTOC/TIC複合体の精製は、単一ステップ精製法、TAP-TOC精製法で達成することができるということです。これは、特定の効率的な方法です。一般的に、この方法に新しい研究者は、葉緑体膜分の分離、洗剤、可溶化、または親和性精製に精通していないため、苦労する可能性があります。
シロイヌナズナズの植物を準備した後、冷たいモルタルと砂の害虫を使用して、液体窒素で3週間齢の苗の10グラムを粉砕します。地盤組織に20ミリリットルの冷たい粉砕バッファーを加えます。よく混ぜて、氷の上で解凍します。
次に、粉砕バッファーで 2 層の素早い濾過材料を浸します。ろ過材料の2つの層を通してホモゲネートを50ミリリットル円錐形遠心分離管にろ過します。濾液を摂氏4度で1,500倍に10分間遠心し、上清を新鮮な冷蔵50ミリリットル円錐形遠心管に移します。
同じ条件でもう一度遠心分離を繰り返します。上清を冷たい38.50ミリリットルの超遠心チューブに移し、冷たい粉砕バッファーで最大35ミリリットルを上に置きます。超遠心分離機を使用して、サンプルを100,000倍g、摂氏4度で1時間遠心分離します。
ガラスのテフロンホモジナイザーを使用して、粉砕バッファー内のグリーンペレットを再懸濁します。100,000倍gと摂氏4度で1時間遠心分離機を使用し、上清を捨てます。ガラスのテフロンホモジナイザーを使用して、1 x粉砕バッファーの 18.75 ミリリットルのグリーンペレットを再懸濁します。
その後、1つのx粉砕バッファーの別の9.375ミリリットルを追加します。9.375ミリリットルの4つのx可溶化溶液を加えて、最終体積を37.5ミリリットルにし、回転シェーカーを摂氏4度で30分間インキュベートします。この後、超遠心分離機を使用してサンプルを100,000グラム、摂氏4度で1時間遠心分離します。
可溶化した膜を含む上清を新鮮な50ミリリットル円錐形遠心分離管に移す。IGGアガロース樹脂を調製した後、可溶化膜の37.5ミリリットルを含む50ミリリットルの円錐管に、先に洗浄したIGGアガロース樹脂を移す。摂氏4度で回転するシェーカーで一晩インキュベートします。
翌日、IGGアガロース樹脂を100g、摂氏4度で5分間沈下する。上清を取り除くためにピペットを使用してください。IGGアガロース樹脂を37.5ミリリットルの緩衝Aで、室温で回転シェーカーに10分間インキュベートした。
テキストプロトコルで概説されているように、沈み込みと樹脂の洗浄を続けます。この後、IGGアガロース樹脂を35ミクロンフィルター付きの500マイクロリットルスピンカラムに移します。平衡のために300マイクロリットルのTEV溶出バッファーでビーズを2回洗います。
次に、TEV溶出バッファーの300マイクロリットルを加え、10マイクロリットルのTEVプロテアーゼを含有する。16°C、350 rpmで2時間、サーモミキサーにビーズを使用してスピンカラムをインキュベートします。次に、スピンカラムを開き、新しいクリーンな1.5ミリリットルチューブに入れます。
このチューブを100回gと摂氏4度で5分間回転させ、溶出物を採取します。本研究では、トランスジェニックA.thaliana植物由来のTAPタグ付き葉膜エンベロープタンパク質複合体が精製される。イムノブロット分析は、TAP-TOC159を単離してTOC複合体のTOC75およびTOC33と相互作用することを確認する。
この葉膜外膜キナーゼ(KOC1)は、TOC159をリン酸化することが知られており、同時単離も行われる。TIC110の存在は、単離されたTAP-TOC159複合体がTIC複合体の成分も含まれていることを明らかにする。FBN1A抗体は、TAP-TOC159複合体を認識せず、汚染がないことを示した。
陰性対照において、免疫沈降NTAPタンパク質は、いずれのTOC、TICタンパク質とも共単離しておらず、TAP-TOC159精製の特異性を確認する。この方法は葉芽細胞タンパク質のインポートに関する洞察を提供することができますが、シロイヌナズナ・サリアナ・ボトルシステムの他の複合体に適用される可能性があります。この手順に従って、ウェスタンブロッティングや質量分析などの他の方法を適用して、既知の成分の存在を実証するか、TOCおよびTIC複合体の新しい成分を同定することができます。
この技術は、塩素細胞タンパク質のインポート分野での研究の道を開き、TOCおよびTIC複合体の新しい成分の機能を探求する道を開いた。
概要
本記事では、TAPタグを用いた葉緑体タンパク質輸送複合体（TOC-TIC複合体）を精製するためのワンステップ親和性分離プロトコルを紹介します。この手法により、質量分析による新たな相互作用パートナーの同定が可能となり、葉緑体機能の理解において極めて重要となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 葉緑体生物学
- タンパク質精製
- 質量分析
背景
- 葉緑体のタンパク質輸送装置は、光合成および食料生産に不可欠です。
- TOCおよびTIC複合体はタンパク質輸送に関与していますが、その完全な組成は十分に解明されていません。
- これらの複合体を単離するための現行の手法は、複雑で時間を要する場合があります。
- 本研究は、精製プロセスの簡略化を目的としています。
研究目的
- TOC-TIC複合体を精製するための簡便なプロトコルを開発すること。
- 葉緑体タンパク質輸送に関与する新たな構成因子の同定を容易にすること。
- Arabidopsis thaliana の他のタンパク質複合体にも適用可能な手法を提供すること。
使用方法
- Arabidopsis苗の調製および液体窒素を用いた研磨。
- 葉緑体膜を単離するための連続遠心分離。
- IGGアガロースレジンを用いたアフィニティー精製。
- 特定タンパク質の存在を確認するための免疫ブロット解析。
主要な結果
- TAP-TOC159複合体の精製に成功し、TOC75およびTOC33と相互作用することが示された。
- TIC110が共単離されたことから、精製された複合体中にTICコンポーネントが存在することが示唆された。
- 陰性対照ではTOCおよびTICタンパク質の共単離が見られなかったため、本手法の特異性が実証された。
- 本手法を用いることで、葉緑体タンパク質輸送メカニズムのさらなる探索が可能となる。
結論
- TAPタグ精製法は、葉緑体タンパク質複合体を単離するための効率的かつ特異的な手法である。
- このアプローチにより、葉緑体タンパク質輸送系の研究を促進することができる。
- 今後の研究において、この手法を活用することでTOCおよびTIC複合体の新たな構成要素を同定することが可能である。
よくある質問
業界における重要性
葉緑体タンパク質輸送複合体の組成を理解することは、植物バイオテクノロジーの進展および作物収量の向上において極めて重要です。TAP-TOC159精製法は、膜タンパク質複合体の効率的な単離を可能にし、葉緑体関連研究におけるターゲットの検証やメカニズムのリスク低減を支援します。この手法は、TOCおよびTIC複合体の新規構成要素を特定する際の予測信頼性を高め、バイオ医薬品に関連する植物系における合成生物学や代謝工学への応用が期待されます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：TOC159を含む複合体を単離して機能解析を行うことで、葉緑体タンパク質導入機構の解析を可能にする。
- 実用的価値：特異的かつ効率的なワンステップ精製戦略を提供し、複合体単離における実験的なばらつきを低減させる。
- 戦略的価値：TOC75、TOC33、TIC110、KOC1などの既知の構成要素との相互作用を確認することで、仮説に基づいたターゲット検証を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 質量分析などのダウンストリームアプリケーションに適した精製複合体を生成し、新規の相互作用因子の同定を可能にする。
- 運用的価値： 複合体プロファイリングのための標準化されたワークフローに適した、再現性のある単離を実現する。
- 戦略的価値： 濃縮された複合体を提供することで検出感度を向上させ、スクリーニングキャンペーンにおけるアッセイ準備を促進する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：穏やかなTEVプロテアーゼ溶出によって複合体の完全性を維持し、機能的な後続解析に向けた本来の相互作用を保存します。
- 運用的価値：イムノブロットおよび質量分析に適した材料を提供することで、発見から検証までの連続性を可能にします。
- 戦略的価値：ネガティブコントロールによる特異性の確認を通じて、偽陽性のリスクを低減し、リスク調整後の研究推進をサポートします。
パイプラインおよびワークフローへの統合
本手法はディスカバリー生物学の段階に適合しており、機能解析やエンジニアリングへの移行前に、ターゲットの同定やパスウェイの解明に資する天然複合体の単離を可能にします。
- 発見生物学：TOC-TIC複合体を単離してタンパク質輸送メカニズムを研究することで、仮説検証やパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：アフィニティーキャプチャおよび後続の分析読み取りに適した、可溶化された膜複合体を提供します。
- 分析：イムノブロットや質量分析による定量的および定性的分析を可能にし、異なる条件間での複合体組成の比較を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：天然の葉緑体膜環境を反映した生化学的に定義された複合体を提供することで、発見から検証へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：Arabidopsis thaliana の他の膜結合複合体にも適用可能な、再利用可能なアフィニティー精製プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：TOC159関連複合体の特異的な単離を可能にすることで、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させる。
- 運用的価値：標準化されたアフィニティー精製と穏やかな溶出条件により、再現性を向上させる。
- 戦略的価値：複合体組成に関する信頼性の高いデータを提供し、ターゲットの優先順位付けを導くことで、意思決定を強化する。
- ポートフォリオへの影響：特異的な複合体単離を通じてターゲット同定のリスクを低減し、葉緑体標的形質へのリスク調整済み投資を支援する。
実施上の検討事項
- 葉緑体膜の単離および界面活性剤を用いた可溶化に関する専門知識が必要です。
- 膜の調製および複合体の捕捉には、超遠心分離機およびアフィニティーレジン（IgGアガロース）へのアクセスが必要です。
- 複合体単離の再現性を確保するためには、研究室間での洗浄および溶出条件の標準化が極めて重要です。
- 他のモデルシステムへ適応させる場合は、タグの接近性と複合体の安定性の最適化が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、TAPタグ付き構築物を発現する形質転換系統の必要性や、タグが本来の機能に干渉する可能性が挙げられます。
