2020年4月24日
トランスラミナー自律システムの使用について説明し、詳細を説明する。このシステムは、ヒト後部セグメントを利用して、セグメント内の圧力(眼内)および周囲の視神経(頭蓋内)を独立して調節し、緑内障視神経障害の特徴を模倣する経層圧勾配を生成する。
この新しい眼の経層自律システムは、人間の後部セグメントを使用して、眼内圧と頭蓋内圧を独立して調節し、経層圧勾配を生成します。TASモデルにより、これまで研究できなかったヒト頭蓋内圧をex vivoの前臨床的な方法で評価することができます。このモデルは、緑内障、外傷性脳損傷、特発性頭蓋内圧亢進症、宇宙飛行関連神経眼症候群などの疾患の研究に使用できる可能性があります。
流入シリンジをセットアップするには、30ミリリットルのシリンジに目的の30ミリリットルの灌流液をロードし、シリンジに3方向ストップコックを取り付けます。ストップコックに0.22μmの親水性フィルターを、0.22μmの親水フィルターに15gのルアースタブアダプターを装着します。シリンジのセットアップから気泡を取り除いた後、チューブをルアースタブアダプターに取り付け、通気孔のないユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。
先ほど示したように 2 つ目のインフローシリンジを設定した後、1 つのシリンジチャネルに 1 つの ICP をラベルし、もう 1 つのシリンジチャネルに 2 つの IOP をラベルします。次に、示したようにアウトフローシリンジをセットアップしますが、シリンジに輸液を装填しません。ヒトの全眼球サンプルを調製するには、視神経鞘を取り外し、後部セグメントから硝子体液を取り除きます。
IOPチャンバーの丸いドームにしっかりとフィットするように、必要に応じて後部セグメントから追加の強膜をトリミングし、鉗子を使用して網膜がセグメントの人間の後部に均等に広がるようにします。次に、視神経を上に向けて丸いドームの上のTASのIOPチャンバーにセグメントを配置し、エポキシ樹脂のOリングと4本のネジを使用して後セグメントをシールします。IOPチャンバーをセットアップするには、チューブをチャンバーのインポートとアウトポートに挿入し、IOPインフローシリンジをインポートに挿入します。
空のIOPアウトフローシリンジセットアップをアウトポートに挿入し、プッシュ/プル方式を使用して灌流媒体を流入ポートにゆっくりと注入して後眼カップを満たし、同時に流出シリンジを介して灌流媒体をゆっくりと引き出して、ラインから気泡を取り除きます。インチューブとアウトチューブの両方に気泡がなくなったら、注入を停止し、ストップコックをオフの位置にロックします。ポートフィルターアセンブリのIOPからシリンジを取り外し、シリンジに追加で30ミリメートルの培地を補充してから、シリンジセットアップをフィルターアセンブリに再挿入します。
ICPチャンバーをセットアップするには、視神経が上部チャンバー内にあるように注意しながら、チャンバーを後部セグメントの背面に置き、上部チャンバーを4本のネジで密閉してから、チューブをICPチャンバーの入出力ポートに挿入し、ICP入力シリンジをインポートに挿入します。 空のICPアウトフローシリンジを出力ポートに送り込み、示したようにシステムを培地で洗い流します。データ集録システムを設定するには、8チャンネル電源とコンピュータの電源を入れ、データ集録ソフトウェアを起動します。[ファイル] と [新規] を選択し、[設定] と [チャネル設定] を選択します。
3 つのチャネルを選択し、示されているようにチャネルの名前を変更します。すべてのチャネルの場合は[範囲]に2ミリボルトを選択し、[計算]列でチャネル1と2の[計算なし]を選択します。「Formula」ウィンドウの「Channels」で「Ch 2」を選択します。
[関数] で [数学] と [マイナス] を選択し、[チャネル] で [Ch 1] を選択します。静水圧トランスデューサをセットアップおよび校正するには、静水圧トランスデューサをマルチチャネルブリッジアンプに取り付けられたトランスデューサラインに接続し、空の30ミリリットルシリンジをチャネル1 ICP圧力トランスデューサのサイドポートに取り付けます。チャネル1 ICP圧力トランスデューサの下部に血圧計を取り付け、サンプリング時間の横にある矢印をクリックしてサンプリング速度を100に設定します。
ブリッジを選択します Amp、メインフィルター、およびゼロ、および圧力トランスデューサーを動かさないように注意しながら、システムがゼロになるのを待ちます。次に、圧力トランスデューサの白いタブをつまんで、血圧計で40ミリメートルの水銀が得られるまでトランスデューサーに空気を押し込み、次に白いタブを放してシリンジと血圧計を取り外します。[単位変換] ページで、[マイナス] を選択し、40 ミリメートルの水銀柱を示す最も高いプラトーを強調表示します。
0.1 の矢印をクリックして 100 と入力し、水銀柱 0 ミリメートルを示す最も低いプラトーをハイライト表示します。0.2 の矢印をクリックし、ゼロを入力して、単位にミリメートル水銀柱を選択し、[OK] をクリックします。[Bridge Amp] ウィンドウで [Okay] をクリックし、先ほど示したように、チャネル 2 の IOP の静水圧トランスデューサをキャリブレーションします。これは、最も高いプラトーには 100 ミリメートルの水銀、最も低いプラトーには 0
ミリメートルです。TAS後セグメントユニットをデータ収集システムに接続するには、TAS後セグメントユニットを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに置き、チャネル1のICP圧力トランスデューサの出力ポートからICPチューブを取り付けます。出力ポートからのIOPチューブをチャネル2IOP圧力トランスデューサーに取り付けます。[チャート ビュー] ページで [サンプリングの開始] を選択し、サンプリング速度を [低速] と 1 分に設定します。
次に、リングスタンドのシリンジを上下に調整して、プロトコルの要件に従ってICPおよびIOP圧力を調整するか、圧力を調整するために灌流ポンプに置きます。この代表的な分析では、両方のチャンバーの平均常圧差の維持が、IOPおよびICP条件のさまざまなパラメーターを通じてテストされました。組織の生存率を確保するために、組織内の培地を48時間ごとに交換しました。
培地交換時に最小限の圧力上昇が起こり、免疫組織化学分析および実験の14日目と30日目のコラーゲンIV発現によって観察された視神経乳頭の生存率または形態に影響を与えませんでした。さまざまな時点で IOP を増加させたり、ICP を減少させたりすると、上昇した層間圧力勾配の範囲を 7 日間維持できます。7日間の経層圧力勾配の上昇では、後部セグメントでカッピングと肥厚が観察され、コラーゲンIVの発現は、実験期間中にシグナル発現が増加したビームの肥厚を示しています。
位相イメージングでは、神経節細胞層内の健康な網膜神経節細胞が明らかになり、対照セグメントにカッピングがなく、一方、高濃度の層間圧勾配培養からの画像は、網膜神経線維層内に網膜神経節細胞が残らず、余分な細胞マトリックスのリモデリングが増加した広範なカッピングを示します。この技術により、研究者は生体力学的疾患のパラダイムを効果的に研究し、ヒトの眼における分子病因を標的とする層間圧を発見することができます。
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本研究では、眼内圧と頭蓋内圧を独立して調節するように設計された、新しい眼球経層自律システム(TAS)を提示します。このシステムは、経層圧勾配を形成することで、眼疾患および頭蓋内圧に影響を与える疾患の研究に向けた、緑内障性視神経症の模倣を目指しています。
トランスラミナー自律システム(TAS)は、ヒトドナーの後眼区において眼内圧と頭蓋内圧を独立して制御することを可能にし、眼科および神経眼科研究における重要な未充足のニーズに対応します。このex vivoモデルは、視神経乳頭の組織構造と複雑性を維持することで、緑内障、外傷性脳損傷、特発性頭蓋内高血圧症、および宇宙飛行に関連する神経眼症に関連する治療仮説のメカニズム的なリスク低減を支援します。また、動物モデルへの依存度を下げ、創薬から前臨床検証までのトランスレーショナルな連続性を向上させ、疾患に関連したシステムを提供することで、前臨床ターゲット検証における予測上の信頼性を高めます。
TASモデルは、ヒトへの適合性が高く、圧力を調節可能なシステムを提供することで、初期のターゲットバリデーションから前臨床研究に至る創薬の連続的なプロセスに統合され、仮説検証、アッセイの準備、およびトランスレーショナルバイオマーカーの整合性をサポートします。