RNAアプタマーおよびリボスイッチをコードするDNAプラスミドを装填した多機能シルクベースのマイクロカプセルの調製

このプロトコルの重要性は、DNAプラスミドテンプレートを半透過性の生体適合性マイクロカプセルに固定化することにより、DNAコード化されたセンサーを機能させる手段を提供することです。提案されたDNA固定化技術は用途が広いです。これにより、異なるin vitro活性化メカニズムを持つ多機能バイオセンサーの作製が可能になります。

これらのマイクロカプセルは、適切なセンシング素子と組み合わせることで、バイオフィルムや臓器などのさまざまな環境でのシグナル伝達分子の放出など、さまざまな生物学的プロセスを研究できると考えています。この手法は、ミクロスケールでの生物学的システム、特にDNAの固定化と分子の混雑が遺伝子活性化の速度論とメカニズムにどのように影響するかについての洞察を提供します。まず、2ミリリットルの微量遠心チューブ内の300マイクロリットルの微粒子に1ミリリットルのポリエチレンイミン溶液を添加することにより、犠牲シリカ(SiO2)微粒子にポリエチレンイミン素層を堆積させます。

ThermoMixerで混合物を周囲条件で毎分800回転で攪拌します。ミクロ粒子を室温で0.2gで1分間遠心分離して回収し、上清を慎重に取り除きます。15分後、0.2gで室温で1分間遠心分離することにより、1ミリリットルのDNaseおよびRNaseを含まない脱イオン水で微粒子を4回洗浄し、各遠心分離後に上清を廃棄します。

次に、DNaseおよびRNaseを含まない蒸留水でDNAプラスミドの濃度を1マイクロリットルあたり50〜200ナノグラムに調整し、調製した溶液の1ミリリットルを使用して、ポリエチレンイミンプライミングされた微粒子にDNAを沈着させます。ThermoMixer上で微粒子混合物を摂氏4度、800rpmで15分間静かに撹拌し、次いで0.2gで1分間遠心分離して微粒子を回収します。テオフィリンリボスイッチをコードするDNAプラスミドをGFPa1と結合してThyRS-GFPa1として、ブロッコリーアプタマーをコードするDNAプラスミドをBrocAptとしてチューブに印を付けます。

上清を慎重に除去し、前に示したように、1ミリリットルのDNaseおよびRNaseを含まない蒸留水で微粒子を4回洗浄し、各遠心分離後に上清を廃棄します。絹フィブロイン層を堆積させるには、DNA吸収された微粒子に再溶解した絹フィブロイン水溶液を1ミリリットル加え、ThermoMixer上で混合物を750rpmで10°Cで15分間穏やかに攪拌します。遠心分離によって微粒子を回収し、前に説明したように、1ミリリットルのDNaseおよびRNaseを含まない蒸留水で1回洗浄します。

遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。0.5ミリリットルのDNaseとRNase蒸留水を加え、微粒子をボルテックスして混合します。次に、微粒子を0.5ミリリットルの100%メタノールで摂氏10度でThermoMixerで5分間処理します。

遠心分離により微粒子を回収した後、ThermoMixer上で100%メタノールで粒子を100%メタノールで処理し、毎分750回転、摂氏10°C、βシート形成を行います。混合物を0.2 gで摂氏4度で1分間遠心分離し、微粒子を回収してから、前に示したように1ミリリットルのDNaseおよびRNaseを含まない蒸留水で粒子を2回洗浄します。ペレット状にしたコアシェル微粒子に8%フッ化水素酸溶液を添加することにより、微粒子のSiO2コアを溶解します。

溶解した粒子溶液を透析装置に移し、ビーカー内で脱イオン水に対して透析します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、透析装置からのシルクマイクロカプセル懸濁液を新しい2ミリリットルの微量遠心チューブに収集します。100マイクロリットルのマイクロカプセルサンプルを8ウェルチャンバーガラススライドの1つのウェルに移し、カプセルを20〜30分間沈殿させてから、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用してイメージングします。

カプセルの懸濁液100マイクロリットルをチャンバーガラススライドの各ウェルにピペットで移します。各ウェルに、分子量が小さいものから高いものまで異なる300マイクロリットルの蛍光色素溶液を順次加えます。ピペッティングで上下させて混合物を混合し、蛍光色素溶液の拡散が平衡に達するまで室温で1時間インキュベートします。

その後、スライドをCLSMに移し、励起波長488ナノメートルの100倍油浸対物レンズを使用して各ウェルをイメージングします。焦点面を調整して対象領域を特定し、最大直径の円の形で表示されるカプセルに焦点を合わせます。マイクロカプセルのサンプルに無細胞成分を順次添加し、チューブを摂氏30度で4時間インキュベートすることにより、in vitro転写/翻訳反応を行います。

励起波長488ナノメートル、GFP/FITCフィルターの発光波長約510ナノメートルを用いて、プレートリーダーで蛍光を確認します。最後に、488ナノメートルと561ナノメートルのレーザーを使用して、CLSMシステム上のシルクマイクロカプセルをイメージングします。本研究では、約4.5マイクロメートルの均質なサイズと約500ナノメートルのシェル厚を持つ堅牢なシルクフィブロインマイクロキャップを作製しました。

中空シルクフィブロインカプセルシェルの透過性は、分子量カットオフ法に従って分析されました。ポリエチレンイミン素層の濃度が増加すると、透過性の高いシェルを持つマイクロカプセルのコロイド安定性が増加しますが、プライム層を排除すると、透過性の低いシェル膜を持つカプセルが凝集します。ThyRS活性化中のGFPa1発現速度は、絹のマイクロカプセルにロードされたDNAプラスミドからのGFPa1遺伝子の活性化が、コントロールの非カプセル化DNAよりも高いことを明らかにしました。

代表的な解析では、in vitro転写・翻訳系におけるインキュベーション前後のDNAコピー1カプセルあたり32個のDNAコピーを充填したsilk fibroinカプセルのCLSM画像を表示しています。シルクフィブロインカプセルの断面強度プロファイルは、GFPa1の発現を示しました。カプセルあたり30個のDNAコピーをロードした20層状のシルクマイクロカプセルの転写速度を、対照の非カプセル化DNAと比較しました。

絹マイクロカプセルからの高出力シグナルは、同等濃度の非カプセル化DNAサンプルよりも高かったため、絹マイクロカプセルの有効性が確認されました。このプロトコールに続いて、いくつかの高解像度顕微鏡法を、固定化状態でのDNAエンタングルメントおよびin vitroでの分離遺伝子活性化プロセスの画像化に適用することができます。この手法は、最小限の人工細胞における分子レベルのダイナミクスに答えるために応用できます。

具体的には、適切な遺伝子要素と組み合わせることで、マイクロカプセルは細胞間コミュニケーションの研究に使用できます。