電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製
2021年11月20日
脂質単層は、構造研究のための2次元(2D)タンパク質結晶を形成するための基礎として何十年も使用されてきました。それらは空気水の界面で安定しており、電子のイメージ投射のための薄い支持材料として役立つことができる。ここでは、生物学的研究のための脂質単層を調製するための実証済みのステップを紹介します。
脂質単層は、末梢膜タンパク質の2D結晶化を促進する支持層として、そして可溶性タンパク質として長年にわたって使用されてきました。この方法は、いくつかの一体性膜タンパク質として、2D結晶化にも適用することができる。しかし、脂質単層への分割を促進するために、洗剤および透析条件を決定するために、より広範な経験調査が必要です。
空気水界面に脂質単層が形成され、脂質の極性ヘッド基が水相で水和したままとなるようである。そして、空気水界面への脂質仕切りの非極性アシルテールは、表面張力を破り、水面を平らにします。脂質ヘッド基の特徴的な化学部分が電荷性質により、溶液中のタンパク質に対する親和性を提供します。
結合を促進し、原則として2Dアレイ形成を行う。脂質単層上に形成された任意の2D結晶は、脂質層上の結晶アレイを持ち上げ、支持するために使用される炭素被覆EMグリッド上の電子顕微鏡に容易に移すことができる。この原稿では、極低温電子顕微鏡イメージングのための脂質単層方法論について述べた。
脂質単層製剤。脂質ストック調製物は、1ml当たり0.01mgを、クロロホルム、メタノールの体積に9:1体積で調製する。8.91 mlのクロロホルムと0.99 mlのメタノールと0.1 mlの1mlの脂質溶液を使用した。
テフロンプレート調製。メタノールバスでテフロンプレートを5分間超音波処理します。お湯で15分洗い、蒸留水で洗い流します。
テフロンプレートを乾燥させて30分間乾燥させ、使用するまで真空状態に保ちます。緩衝槽上の脂質単層の形成推定運転時間は1時間半です。
ペトリ皿にタイプ1のフィルターペーパーを入れ、濾紙の上にテフロンブロックを並べます。テフロンプレートのウェルに60マイクロリットルのバッファーを充填します。慎重にバッファー表面のドロップの上に液体混合物を追加します。
理想的には、ハミルトンシリンジを使用して1滴あたり1マイクロリットル。フィルターペーパーを蒸留水で濡らし、ペトリ皿の湿度を保ちます。室温で60分間インキュベートすると、クロロホルムが蒸発し、バッファーの表面に脂質の単層が形成されるべきである。
脂質単層上のEMグリッドの適用推定運転時間 1 時間半。各バッファーリザーバーの表面にカーボンサイドを排出するグローなしで、カーボンコーティングされたEMグリッドを穏やかに配置します。
慎重にサイド注入によくタンパク質を注入し、1つのマイクロモルの周りのウェルで最終的なタンパク質濃度を使用します。室温で60分インキュベートします。約 20 ~ 30 マイクロリットルのバッファーをサイト注入ポートに静かに注入し、グリッドを Teflon ブロックの表面の上に上げます。
これにより、ピンセットでグリッドを拾い上げ、液滴から垂直に持ち上げます。代表結果。EMグリッド上に堆積した脂質単層は、コントラスト染色を行うことなく透過型電子顕微鏡下で可視化することができます。
この単層存在は、そのビーム経路に標本を含まない領域とのコントラスト差によって認識することができる。脂質単層被覆率を有する領域は、カバレッジのない領域よりもコントラストが低い。空の穴を通る電子ビームは散乱しないため、明るい照明を示します。
結論として、脂質単層法は、その単純性のためにタンパク質構造を研究する機会を提供する。2D結晶化のプロセスを容易にする代替アプローチを提供してもよい。
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概要
脂質単分子膜は、タンパク質の二次元結晶化のための安定した基盤として機能し、構造研究を促進します。この手法は、特に周辺膜タンパク質や可溶性タンパク質に有用であり、慎重な最適化を行うことで、内在性膜タンパク質にも適応させることが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生物物理学
- 構造生物学
- 生化学
背景
- 脂質単分子層が気液界面に形成されます。
- 親水性の頭部基は水相の中で水和状態を維持します。
- 非極性のアシル鎖は気液界面に分配されます。
- 脂質頭部基の化学的性質がタンパク質の親和性に影響を与えます。
研究目的
- 脂質単分子膜を調製する方法を提示すること。
- さまざまなタンパク質の結晶化を支援すること。
- イメージング技術の向上により、構造研究を促進すること。
使用した手法
- 気液界面における脂質単分子層の調製。
- 界面活性剤および透析条件の最適化。
- タンパク質分配の経験的調査。
- 構造解析のための電子イメージング技術。
主な結果
- 脂質単分子層は、タンパク質の結晶化を効果的に促進します。
- 特定の条件により、単分子層に対するタンパク質の親和性が向上します。
- さらなる最適化を行うことで、膜貫通タンパク質の結晶化が可能です。
- 本手法は、電子イメージングのための安定したプラットフォームを提供します。
結論
- 脂質単分子層は、構造生物学において汎用性の高いツールです。
- これにより、周辺膜タンパク質と内在性膜タンパク質の両方の研究が容易になります。
- 最適な結果を得るための条件を精査するには、さらなる研究が必要です。
よくある質問
産業界における重要性
脂質単分子層法は、制御された二次元タンパク質結晶化を可能にし、膜タンパク質および可溶性標的の構造決定を支援します。このアプローチは、生物物理学的特性評価のための再現性のあるプラットフォームを提供することで標的のバリデーションを強化し、初期段階の創薬における不確実性を低減させます。また、本手法は高分解能の構造的知見を通じてメカニズム的なリスク低減を促進し、リード化合物の最適化やポートフォリオの意思決定に寄与します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：標的機能に関連するタンパク質-脂質相互作用およびコンフォメーション状態の解析を可能にする。
- 運用的価値：標的の安定性と結合能を評価するための標準化されたシステムを提供する。
- 科学的価値：ほぼ天然の状態での構造解析を可能にすることで、標的の機能的検証をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：高解像度スクリーニングアプリケーションに適した、均質で秩序あるタンパク質アレイを生成する。
- 運用上の価値：サンプル調製の再現性を確保し、チーム間でのアッセイの一貫性に不可欠な要素となる。
- 科学的価値：機能アッセイデータとの相関を可能にする、定量可能な構造的出力を生成する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：膜タンパク質ターゲットの構造的知見を提供し、疾患メカニズムの理解を支援する。
- 実用的価値：後続のcryo-EMワークフローと互換性のある、転移可能な試料を作成する。
- 科学的価値：構造的特徴を薬理活性に結びつけることで、予測の信頼性をサポートする。
パイプラインおよびワークフローの統合
脂質単分子層法は、構造特性解析を通じてターゲットの検証およびリード化合物の同定を支援し、初期の創薬ワークフローに組み込まれています。
- 探索生物学：タンパク質の配置と相互作用の構造可視化により、仮説検証を促進します。
- スクリーニング：均一な2D結晶を生成することで、一貫した生物物理学的測定を可能にし、アッセイの準備を整えます。
- 分析：高解像度のイメージングデータを提供し、さまざまな条件下での構造状態の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：標的メカニズムを解明することで、構造的知見を前臨床段階の継続的な研究へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用：複数のタンパク質標的にわたる構造スクリーニングのための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：直接的な構造観察により、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：構造研究のための試料調製における再現性と標準化を強化する。
- 戦略的価値：ターゲット選定における構造的な不確実性を低減し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：検証済みの構造および機能データに基づいた、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 脂質の取り扱い、タンパク質精製、および界面科学に関する専門知識が必要です。
- ハミルトンシリンジやテフロン基板などのクリーンルーム対応設備へのアクセスに依存します。
- 研究室間でのバッファー条件およびインキュベーション時間の標準化が必要です。
- 異なるタンパク質クラス、特に膜貫通タンパク質に対する適応上の検討事項が含まれます。
- 特定のターゲットに対する界面活性剤および透析条件の経験的な最適化が必要であるという制約があります。
