リ モシラクトバチルス・ロイテリ におけるエレクトロポレーションと形質転換確認の方法 DSM20016
2023年6月23日
ここでは、 Limosilactobacillus reuteri DSM20016を使用するためのプロトコル、増殖、プラスミド形質転換、コロニーPCR、蛍光レポータータンパク質測定、および限定的なプラスミドミニプレップ、および一般的な問題とトラブルシューティングについて詳しく説明します。これらのプロトコルにより、DSM20016中のレポータータンパク質の測定、またはレポーターが関与しない場合はコロニーPCR による 確認が可能になります。
L.Reuteri、特にこの株DSM20016は、堅牢で自然なヒト腸の共生であり、胃腸管全体での治療的送達と疾患の検出に大きな期待を寄せています。この作業は、DSM20016をこの種のアプリケーションの合成生物学シャーシとして位置付けるのに役立ちます。乳酸桿菌には特定のモデル生物はありません。
好ましい種は存在しますが、それらは通常、特定の研究目的に偏って選択されます。細菌ファミリー内の変異は断片化されたプロトコルにつながり、一部は出版物をさかのぼって変更を繰り返しています。初心者にとって、何が有用で何が役に立たないかを正確にフィルタリングすることは非常に困難です。
DSM20016の変容のための1つの論文は存在しますが、それは現代的ではありません。他のラクトバチラレスファミリーメンバーのための最新のプロトコルは存在しますが、それらはDSM20016されていません。ここでは、DSM20016エレクトロポレーションのための使いやすく、一元化された、最新のプロトコルの完全なセットを提供するよう努めています。
このプロトコルセットは、以前のDSM20016探査プロトコルよりも大幅に近代化され、いくつかのぶら下がっているスレッドを解明し、以前はあまり明確ではなかった部分を強調します。プロトコルセットも完全であり、特にDSM20016については、他の非DSM20016プロトコルが完全に互換性がない株です。私たちの主な目標の1つは、微生物を安価なセンサーおよびデリバリーシステムとして使用することです。
私たちは腸疾患の専門家と協力して、DSM20016を使用して胃腸管の状態を感知し、必要に応じて治療法を提供しています。
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概要
本記事では、ヒト腸内の強固な共生菌であるLimosilactobacillus reuteri DSM20016を扱うためのプロトコルを紹介します。これらのプロトコルには、培養、プラスミド形質転換、コロニーPCR、および蛍光レポータータンパク質の測定が含まれます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- 合成生物学
- 胃腸の健康
背景
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016は、ヒトの腸内に自然に存在する共生菌です。
- この菌株は、治療薬の送達や疾患検出への応用が期待されています。
- この分野のプロトコルは断片化していることが多く、参照が困難です。
- 研究目的によって、選択される細菌種に偏りが生じる可能性があります。
研究目的
- DSM20016を用いた操作のための明確なプロトコルを提供すること。
- レポータータンパク質の測定およびコロニーPCRによる確認を容易にすること。
- プロトコルにおける一般的な問題点およびトラブルシューティングに対処すること。
使用した手法
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016の培養。
- プラスミド形質転換法。
- 遺伝子改変確認のためのコロニーPCR。
- 蛍光リポータータンパク質の測定。
主な結果
- 増殖および形質転換のプロトコルを確立した。
- コロニーPCRにより、目的の遺伝子構築物の存在を確認した。
- 蛍光レポータータンパク質の測定を効率的に行った。
- 一般的によくある問題に対するトラブルシューティングガイドラインを提示した。
結論
- これらのプロトコルは、研究におけるDSM20016の有用性を高めます。
- これらは、将来的な合成生物学への応用のための基盤を提供します。
- 明確なガイダンスにより、研究者が断片的な文献を効率的に参照することが可能になります。
よくある質問
業界における重要性
Limosilactobacillus reuteri DSM20016のための、集約された株特異的なエレクトロポレーションおよび形質転換確認プロトコルは、腸管標的アプリケーションに向けた合成生物学シャシー開発における重要な課題を解決します。標準化されたワークフローにより曖昧さが排除され、治療薬のデリバリーや疾患センシングのための共生微生物の再現性のあるエンジニアリングが可能になります。これにより、DSM20016は、胃腸の健康を標的としたバイオ医薬品研究開発の初期段階における信頼性の高いプラットフォームとして位置付けられます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 機能的な標的の解析に向けた、DSM20016の堅牢な遺伝子操作を可能にする。
- 主要な共生菌株における形質転換の実現可能性を明確にすることで、生物学的リスクの低減をサポートする。
- 合成生物学パイプラインにおける菌株選択の予測信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- DSM20016をスクリーニング可能なシャーシとして調製するための、検証済みプロトコルを提供します。
- 形質転換およびレポーター測定を標準化し、再現性のあるアッセイ出力を実現します。
- 疾患に関連するシステムにおいて、設計された構築物の信頼性の高い評価を可能にします。
翻訳および前臨床研究
- 腸管標的の治療薬デリバリーというトランスレーショナルな目標に合わせて、設計されたDSM20016を整合させます。
- 発見から胃腸モデルを用いた前臨床検証までの継続性をサポートします。
- 設計された共生菌をトランスレーショナル研究へと進める際のリスクを軽減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
これらのプロトコルは、初期探索とアッセイ開発のインターフェースを統合し、DSM20016における遺伝子工学から機能スクリーニングまでの効率的な進展を可能にします。
- 探索生物学：共生シャーシにおける仮説検証およびパスウェイ工学を支援します。
- スクリーニング：再現性のある形質転換と、ダウンストリームワークフローのための定量的なレポーター読み取りを提供します。
- 分析：比較分析のための形質転換効率およびレポーター発現の測定を可能にします。
- トランスレーショナル研究：腸内関連のコンテキストにおける、エンジニアリングされた菌株の前臨床評価の基盤を提供します。
- エンタープライズ再利用：DSM20016を、合成生物学の研究開発のための再利用可能な標準プラットフォームとして確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： コメンサル菌エンジニアリングにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： 菌株操作のための標準化され、再現性があり、かつ拡張可能なプロトコルを提供する。
- 戦略的価値： 初期段階の腸内マイクロバイオームプログラムにおける、go/no-go判断および資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： エンジニアリングされた微生物治療薬のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 微生物遺伝学およびエレクトロポレーション技術の専門知識が必要です。
- エレクトロポレーション装置およびプレートリーダーへのアクセスが必要です。
- プロトコルの導入およびトラブルシューティングのため、チーム間での標準化が求められます。
- 遺伝子型の変動により、他のLactobacillales株への適応が必要になる場合があります。
- 本プロトコルの適合性はDSM20016に特異的であり、他の株に一般化できない可能性があります。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
