アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

こんにちは、ケビン・ウォンです。コーネル大学バイオ流体研究室の工学修士課程に在籍しています。本日は、アガロースベースのマイクロ流体デバイスを用いて、マウス神経幹細胞に対するEGF（上皮成長因子）の影響を研究する方法についてお話しします。

このデバイスは、基本的に幅150 µmの3本のマイクロ流体チャネルで構成されています。一方のサイドチャネルにEGFを、もう一方のサイドチャネルにバッファーをポンプで注入します。これにより、中央チャネルにわたって静的な線形化学勾配が形成されます。

EGFはアガロゲル内を容易に拡散するため、神経幹細胞をセンターチャネルに播種し、その遊走の経過を顕微鏡で観察します。したがって、本デバイスは基本的に、チューブ接続用のすべての入口および出口を備えたプレキシグラスの上層と、その下に4つのパターンデバイスを含むアガロゲル膜で構成されています。

これはPDMSスペーサーで囲まれており、これによりデバイス全体の厚さが一定に保たれます。PDMSとゲルは、ectでコーティングされたガラススライド上にアセンブルされます。これにより、細胞がガラススライドに接着しやすくなります。

さらに、ステンレスプレートを使用してデバイス全体を固定し、ネジでデバイスを挟み込みます。野生型細胞株には、野生型EGF受容体を過剰発現させるレトロウイルスベクターを導入し、デルタ細胞株には、EGFリガンドがなくとも恒常的に活性化する変異型EGF受容体を導入しています。それでは、まずマイクロ流体デバイスの組み立て工程について説明します。

まず、マスターのシリコンマイクロチャネルのレリーフ構造の周囲にPDMSスペーサーを配置しました。次に、Agaroseを0.3 g量り取ります。そして、CO₂インデペンデント培地を10 mL用意し、それをAgaroseに加えます。

ピペッティングを行い、AgrosパウダーをCO2独立培地と混ぜ合わせます。これで電子レンジにかける準備ができました。ご覧の通り、Agrosは液状になりましたが、まだいくつかの顆粒が残っています。

顆粒を溶解させ、気泡を取り除くために、全体をゆっくりと回転させます。次に、溶融したAgaroseをシリコンマスターのレリーフ構造の上に注ぎ、滅菌済みのガラススライドを取り出してPDMSスペーサーの上に置きます。このとき、Agaroseゲルの大部分の気泡を押し出すように、角度をつけて配置します。

圧力を加え、Agaroseシェルが凝固するまで圧力を加え続けます。1〜2分後、凝固しました。ここで、スライド上の余分なAgaroseを取り除きます。

次のステップは、ガラススライドをそっと滑らせて取り出すことであり、このガラススライドは廃棄して構いません。次に、あらかじめフィブロネクチンでコーティングしておいたガラススライドへ、パターン化されたハイドロゲルを慎重に転写します。具体的には、このプラスチック製滅菌シートを使用して、PDMSスペーサーと共にパターン化されたハイドロゲルを持ち上げ、チャネル側を下にしてスライドへと転写します。

これがガラススライドにしっかりと固定されたので、プラスチック製マニホールドがチャネルに到達できるよう、個々のリザーバーに穴を開けます。これには小型の金属製穴あけパンチを使用します。これで、デバイスへの穴あけ作業が完了しました。

マイクロチャネルの乾燥を防ぐため、CO2独立培地を 500 µL 加え、1〜2分間静置します。1〜2分後、余分な培地を除去し、パターン・アガロスのパンチ穴をプレキシグラス・マニホールドの入口および出口の穴に合わせて整列させます。穴が正しく配置されたら、しっかりと押し付けて密閉します。

次に、ステンレス製マウントの上にプレキシグラス製マニホールドを配置し、ネジを用いてデバイスを緩やかに挟み込みます。ネジを締めすぎるとチャネルが潰れてしまうため、細心の注意を払います。また、内部のアグロスゲルのパターンがずれるのを防ぐため、時計回りにネジを締めていきます。1 mLの培地を吸引し、このシリンジを使用してデバイスのテストを行います。

ご覧のように、各マイクロチャネルに液体を注入し、各出口から液体が出てくるかを確認しています。現在、組み立てたデバイスを顕微鏡の環境チャンバー内に設置しています。ここは37 °Cに維持されており、これによりデバイスを温めて、細胞を播種する準備を整えます。

ご覧のように、すでに2本のペリスタルティックポンプ用チューブを装置に通してあります。現在は、実験の準備としてチューブ内をPBSでフラッシングしています。それでは、チューブのセットアップを行います。

あらかじめ穴が開けられたキャップに、パラソルポンプのチューブを通します。各チューブには、入口と出口を識別できるように、それぞれ特定の数のノッチ（切り込み）が入っています。例えば、ノッチが4つあるチューブには、10 ng/mLの溶液を注入します。

次に、EGF溶液のチューブをデバイスに取り付けます。各デバイスのノッチの数に応じてチューブを取り付けることで、取り込む溶液の種類と対応させます。

次に、流出チューブを取り付けます。培地が実際に流出チューブを流れており、チャネル内に閉塞がないことを確認するため、透明なタイゴンチューブを使用します。それでは、ペリスタルティックポンプを起動します。

それでは、センターチャネルへの細胞播種の手順を開始します。まず、センサーチャネル内の余分な培地を除去します。これで細胞が確認できます。

細胞はすでにCO2非依存性培地中で懸濁されています。次に、センターチャネルの入口に60 µL、出口に20 µLを播種しました。これにより、重力駆動流によって細胞が播種されることが期待されます。

この手順を他の2つの感度チャンネルでも繰り返し、細胞の定着が成功したか顕微鏡下で観察します。これで細胞がガラススライドに接着しました。数分後には細胞が広がり始め、固有の形態へと変化していきます。本日は、実際のデバイスの組み立て、試薬の調製、およびデバイス内での細胞遊走をイメージングするために使用した顕微鏡技術について解説しました。

結論として、このデバイスが、特に臨床現場においてより幅広く適用されることを期待しています。図1の横軸はC 17.2細胞の軌跡を、縦軸は増加するEGF濃度を示しています。

ここでは、同一のEGF濃度を用いて実験に使用したC 17.2細胞のさまざまな株の軌跡を示しています。親細胞のデータからは、10 ng/mLのEGF濃度勾配で運動性にピークがあることが分かり、これはより高いEGF濃度では受容体がリガンドで飽和したことを示しています。また、野生型のデータでは、100 ng/mLのEGF濃度で運動性の増加が見られます。

これは、高濃度のEGFにおいて受容体が飽和していないことを示しています。EGF受容体を過剰発現するように設計されているため、この結果は妥当であると言えます。最後に、delta細胞株のデータから、細胞の遊走性はEGF濃度にほぼ依存しないことが示唆されます。

変異型EGF受容体は、EGFの存在に関わらず活性化するように設計されているため、これは予想通りの結果です。