マウス脳脊髄サンプルの抽出および組織透明化調製

私たちの研究は、中枢神経系が認知機能をどのように媒介し、免疫系と相互作用するかに焦点を当てています。私たちは、脳と脊髄を検査する方法を改善し、これらの相互作用に関する基本的な問題に対処することを目指しています。これらの方法は、脳全体と脊髄を無傷に保つため、組織のクリアリングを使用して細胞をより徹底的にマッピングするのに役立ちます。また、プロセスがより迅速かつ正確になり、従来の切片化およびイメージング方法と比較して時間とミスが削減されます。

私たちは、脳と肺に接続された脊髄領域をマッピングし、 を生み出しました。私たちの研究は、脳、脊髄、肺の間の神経免疫コミュニケーションの探索に焦点を当てます。そして、この相互作用が免疫応答にどのように影響するか。

[講師]まず、スチール製のクランプを使用してマウスの手足を幅の広いアクリル板に固定します。はさみを使用して、2つの大腿骨の間の皮膚を切り、横隔膜に達するまで上向きに切り続けます。はさみとまっすぐな鉗子を使用して心臓を露出させ、横隔膜を通して胸部の両側を開きます。灌流チューブに取り付けられた0.7ミリメートルの輸液針を左心室に挿入し、右心耳に1〜2ミリメートルの切開を行います。灌流後、眼科用ハサミを使用してマウスの背中と頭の皮膚を分離します。両肢の上後縁を結ぶ線が脊柱と交差する点で脊椎を切断します。マウスの首と背中から筋肉と脂肪組織を取り除き、背骨と頭蓋骨を露出させます。静脈ハサミで、脊椎と脊髄の左右の間の正中線の隙間に沿って椎管の下端から切ります。次に、切断された脊椎の上部と両側を取り除き、脊髄を露出させます。脳の接続に到達するまで手順を繰り返します。静脈ハサミの片方の刃の先端を大孔と脳の間に置きます。正中矢状縫合糸に沿ってスライドさせて切断し、頭蓋骨を開きます。鉗子を使用して頭蓋骨を取り除き、脳を露出させます。次に、鉗子と静脈ハサミを使用して、マウスの脳脊髄組織を頭蓋端から取り除きます。解剖鉗子を使用して、実体顕微鏡下で脊髄膜を除去します。次に、縫合糸を使用して、脳脊髄サンプルを固定プレートに固定します。サンプル量の少なくとも20倍の4%パラホルムアルデヒドを加えます。固定後、パラホルムアルデヒドを廃棄し、サンプルをPBSで3回洗浄します。まず、抽出したマウス脳脊髄をパラホルムアルデヒドで固定します。脂質除去液の場合、溶液AとBを9対1の質量比で混合します。50ミリリットルの脂質除去液を50ミリリットルの遠心分離管に加え、固定組織をその中に入れます。溶液Cでインキュベートした後、溶液を変更し、サンプルを溶液Cに完全に浸した培養皿をスケールライン付きのライトボックスに置きます。ゲル溶液を調製するには、147グラムの溶液Cと3グラムのアガロースを200ミリリットルのガラス瓶に加えます。成分を攪拌棒でよく混合し、アガロースが溶けるまで電子レンジで加熱します。ゲル溶液を摂氏37度に設定した実験用オーブンに移します。37°Cのテンパリングゲル溶液を2mmの深さで型に注ぎ、4°Cの冷蔵庫で半固体になるまで30分間冷却します。屈折率が一致したサンプルを金型に入れ、サンプルの上部のレベルまたはわずかに下までゲル溶液を追加します。型を摂氏4度の冷蔵庫に戻して2時間置きます。カバースリップで覆い、再び冷蔵します。ピンセットでカバースリップを取り外し、埋め込まれたサンプルを取り出します。50ミリリットルのチューブに30ミリリットルのイメージング溶液を加え、サンプルを溶液に浸します。502接着剤を塗布してサンプルをサンプルホルダーにしっかりと貼り付けてから、ホルダーをイメージングデバイスに固定します。スキャン ソフトウェアを実行し、倍率セクションで 4 倍の倍率レベルを選択します。キャリブレーションボタンをクリックして、キャリブレーションモードをアクティブにします。プレビューボタンをクリックしてプレビューモードに入ります。次に、Z方向の移動ボタンをクリックして、生成されたライトシートがサンプルを通過するまで、サンプルチャンバーの下部からサンプルをゆっくりと上に移動します。適切なレーザーチャネルと照明モードオプションを選択します。サンプルのスキャンパスの方向を選択します。自動スキャンボタンをクリックして、サンプルの画像のキャプチャを開始します。このプロトコルは、鮮明なイメージングのために無傷の蛍光シグナルを維持しながら、マウスの脳と脊髄全体を保存することに成功しました。脳脊髄サンプルの蛍光イメージングにより、詳細な神経構造がはっきりと視覚化されました。 高倍率の画像により、個々の蛍光標識細胞の視覚化が強化されました。