不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

この手順の目的は、不連続ショ糖密度勾配を用いて、マウス脳皮質から翻訳活性を持つシナプトニューロゾームを調製することです。まず、マウスの皮質を回収してホモジナイズし、次にそのホモジネートを遠心分離します。その後、遠心分離後のホモジネート（上清）を、あらかじめ調製したショ糖勾配に添加します。

最終ステップは、遠心分離してシナプトソーム画分を回収することです。最終的に、ウェスタンブロット分析および S 35 メチオニン取り込み実験により、シナプトソーム画分がシナプス成分を豊富に含み、翻訳活性を有していることが示されます。遠心分離やろ過などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、第一に、密度勾配を利用することで機械的な損傷が回避されること、第二に、Percoll が細胞およびその構成成分に対して低毒性であることです。

一般的に、この手法に不慣れな方は、タイミングが極めて重要であるため、このプロトコルに苦労することがあります。皮質を回収した後は、速やかに操作を完了させる必要があります。操作を開始するには、付随する論文に記載されている通り、GMバッファーに規定量のSIPを加えて、3%、10%、15%、23%の勾配層を調製し、よく混合します。

15%、10%、および3%の等張ペロール溶液を、それぞれ2 mLずつピペッティングして、キャップ付きのBeckman遠心管に層状に注ぎます。P1000ピペットを使用し、各層の界面が明確に判別でき、層同士が混ざり合わないようにします。作製した勾配溶液は、使用前に4 °Cで少なくとも20分間静置してください。

本手順を開始する前に、付随する論文の記載に従い、その他の必要な溶液を準備してください。P 13からP 21のマウスを安楽死させ、首の後ろと頭部に70% ethanolをスプレーして解剖の準備をします。その後、鋭い鋏を用いて、頭蓋底で脊髄を切断します。

次に、頭蓋骨上部の皮膚を取り除きます。頭頂骨と間頭頂骨の間、または大脳と皮質領域の間で、頭蓋骨を側方から切開します。その後、矢状縫合に沿って頭蓋底から鼻に向かって頭蓋骨を切開します。

このステップでは、各半球を横に引いて、柔らかい頭頂骨を注意深く除去します。その後、小脳の上の脳にスパチュラを挿入し、皮質を掻き出します。それを氷冷GMバッファーに入れ、さらに皮質を回収するために同様の手順を繰り返します。

次に、皮質を氷冷GMバッファーで洗浄します。その後、2つの皮質を5 mLの冷GMバッファーを含むグラス・ダウン・ホモジナイザーに移します。まず緩いペスルのペスルAで5〜10回、続いて密着型のペスルBで5〜10回、皮質を穏やかにホモジナイズします。

ストローク数は、使用するホモジナイザーによって異なります。ホモジナイズした検体を15 mLコニカルチューブに移します。1000 ×gで遠心分離します。

細胞破片と核をペレット化するため、Allegra six KR遠心機を用いて4 °Cで10分間遠心分離します。各ペルオキシソームまたはスクロース密度勾配に対し、上清を2 mLずつ重ねて加え、チューブにキャップをします。その後、Beckman J 2 21遠心機の固定角ローターを用い、4 °Cで32,500 ×gで5分間遠心分離します。

完了後、適切なアダプターを使用して、グラジエントにより強いSNバンドが得られていることを確認し、SNバンドより上の溶液をピペットで吸い出して廃棄します。ガラスパスタピペットを用いて、15%から23%の界面にあるSNバンドを吸い出します。通常、1回のグラジエントで約0.9から1.1 mLのSNが得られます。その後、円錐チューブに移し、氷上で保存します。

次に、10倍濃度の刺激バッファーを全量の10分の1量添加し、SNSの塩濃度を調整します。必要に応じて、最終濃度が12 nMとなるように塩化カルシウム（1000倍濃度）を添加します。続いて、非特異的な興奮を抑制するため、最終濃度が1 µMとなるように1 mMのTTXストック溶液を添加します。

次のステップは、タンパク質翻訳研究などの適切なダウンストリームアプリケーションにSNSを使用することです。その他のアプリケーションでは、Pierce SDS page sample prep kitを用いてSN溶解液を精製または濃縮させることができます。SNSのタンパク質濃度は、micro BCA protein assay kitを用いて測定できます。

ここに6つのバンドまたは分画の例を示します。マウス皮質をホモジナイズし、不連続ペルオキシドショ糖密度勾配遠心法で分離したところ、濃縮されたSNSは23～15%界面のバンド5に含まれていました。このバンドを回収し、電子顕微鏡で観察しました。完全なシナプス小胞の例、およびシナプス前・後要素の保持が、こちらのウェスタンブロットに示されています。

不連続スクロース密度勾配分画におけるSNバンドのシナプスマーカーの増加と不純物の減少が示されており、グルタミン酸添加による S 35 methionine 取り込みの増加が、新規タンパク質合成によるものであることが確認されています。タンパク質合成阻害剤である 40 micromolar のアニソマイシンを添加しました。この図は、基底レベルと比較して、グルタミン酸の有無にかかわらず、アニソマイシンの存在下で S 35 methionine の取り込みが著しく減少することを示しています。

したがって、不連続パーコアショクロース密度勾配を用いて、タンパク質翻訳の研究に使用可能な、活性が高く比較的純度の高いSNSを迅速に調製することができます。この図は、不連続パーコアショクロース密度勾配のバンド5に、最も高いレベルのde novoタンパク質合成能が含まれていることを示しています。比較として、均質化した皮質を孔径の小さい順に一連のフィルターに通した後、不連続パーコアショクロース密度勾配で遠心分離して調製したSNSには、不連続パーコアショクロース密度勾配法で調製したSNSよりも破砕膜が多く、完全なSNSが少なくなっています。不連続パーコアショクロース密度勾配法を用いて調製したSNSは、ろ過法を用いて調製したSNSよりもde novoタンパク質合成活性が高いことが示されています。

若齢マウスから調製したSNSは、高齢マウスよりも翻訳活性が高いことが示されています。このビデオを視聴することで、マウス皮質をホモジナイズし、スイングバケットローターでホモジネートを遠心分離し、さらに固定角ローターで上清をショ糖密度勾配遠心し、得られたシナプトニューロゾームバンドを回収することで、翻訳活性を持つシナプトニューロゾームを単離する方法を十分に理解できるはずです。