低密度好中球の効率的な精製のための迅速な磁気マイクロビーズ法

末梢血単核細胞内の低密度好中球を研究し、その機能を特徴づけて異なる疾患における役割を明らかにします。低密度好中球は健康な血液では稀ですが、全身性エリテマトーデスやがんなどの疾患では著しく増加します。まず、抗凝固剤としてヘパリン10単位を15ミリリットルの円錐形遠心分離機チューブに添加します。

次にPBSに6%デキストランT500を2ミリリットル加えます。健康な成人ボランティアから10ミリリットルの血液を静脈穿刺で採取します。別の新しい15ミリリットルの遠心分離機チューブに、密度勾配培地を5ミリリットル加えます。

赤血球に触れずに慎重にピペットで血漿を抽出し、培地の上に重ねて2つの別々の相を形成します。チューブを516gで4度の温度で20分間遠心分離します。PBMCを単離するには、PBMCバンドより上の血漿を細胞を乱さずに吸引して廃棄します。

プラズマと培地の間に単核細胞帯を採取し、培地の収集を最小限に抑えましょう。PBMC(発酵液)入りチューブにPBSを20ミリリットル追加し、400gで4度の温度で5分間遠心分離します。上清液を慎重に吸引し、チューブをこすってペレットを分離します。

細胞を再懸浮させるために10ミリリットルの冷たいPBSを加えます。好中球を分離するには、培地をピペットで取り出した後、チューブをこすって細胞を分離します。次に冷たいPBSを10ミリリットル加えます。

次に細胞を新しい50ミリリットルの円錐形遠心分離機チューブと遠心分離機に移します。上澄液を吸引し、再度チューブをこすり取ってください。次に冷たい低張液10ミリリットルをチューブにピペットで入れ、優しく混ぜます。

ちょうど1分間、優しく混ぜます。冷たい高張液を10ミリリットル素早く加えて等張溶液にします。その後、ニューバウアーチャンバーを使って好中球を数え、純度が95%以上であることを確認し、遠心分離して細胞ペレットを得ます。

その後、ペレットを冷たいPBSで再懸浮させます。末梢血の単核細胞を400gで4度摂氏で5分間遠心分離する。上澄液を除去した後、細胞を120マイクロリットルのコールドウォッシュバッファーに再懸濁させます。

次に、細胞懸濁液にCD66b磁気マイクロビーズ35マイクロリットをピペットで送り込みます。混合物を暗闇で4度Cで30分間孵化します。次に、チューブに1ミリリットルのコールドウォッシュバッファーをピペットで送ります。

チューブを400gで3分間遠心分離します。上澄液を除去した後、チューブをこすって細胞ペレットを分離します。そして細胞を1ミリリットルのウォッシュバッファーに再懸浮させます。

磁石の上に磁気分離カラムを置きます。カラムに0.5ミリリットルのウォッシュバッファーを加え、完全に通過できるようにします。再懸濁した細胞を1ミリリットル単位でカラムに移し、バッファーを一滴ずつ通過させます。

洗浄後、カラムをマイクロ遠心分離機のチューブに移します。次に、1ミリリットルのウォッシュバッファーをカラムにピペットで注入します。次にプランジャーを柱の上に差し込みます。

優しく圧をかけて細胞を溶出させます。その後、プランジャーを外してカラムを新しいマイクロ遠心分離機のチューブに置きます。カラムにさらに1ミリリットルのウォッシュバッファーを加えます。

次に再びプランジャーを挿入し、優しく圧力をかけて残りの細胞を洗い出します。両方のマイクロ遠心分離管を800gで3分間遠心分離します。両方のチューブから細胞ペレットを1ミリリットルの冷たいPBSに再懸浮させます。

セルの懸流は冷やしておけ。精製細胞をPBS中の1%胎児用牛血清で作られた標識バッファーに再懸濁させます。250マイクロリットルの懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に移します。

好中球膜分子に対する対応する抗体をチューブに加えます。その後、光を遮った状態で4度の温度で30分間培養します。次に、チューブにPBSを1ミリリットルのピペットで送ります。

チューブをマイクロ遠心分離機で800gで3分間回します。上清液を吸引して吸い出してください。チューブを軽く叩いてペレットを割ります。

細胞を1%パラホルムアルデヒド0.5ミリリットルで再懸濁します。その後、細胞を4度の温度に保ち、光から保護してフローサイトメトリーによる分析を行います。フローサイトメトリーを用いてサンプルを解析し、1サンプルあたり1万件のイベントを捕捉します。

健康な個体の低密度好中球は末梢血単核細胞の約5%を占め、磁気隔離プロトコルでは約98%の回復率で低密度好中球が検出されました。好中球は膜マーカーCD10、CD11b、CD15、CD62L、CD66bを発現します。磁気的に精製された低密度好中球は好中球と同じ膜マーカーを発現しました。

精製された低密度好中球は多葉核を示し、好中球と似た大きさでした。好中球と低密度好中球の両方がPMA刺激に反応して活性酸素種を生成し、低密度好中球は好中球よりも高いレベルを生成しました。低密度好中球はPMA刺激に反応して好中球細胞外トラップを放出し、これはDNAとエラスターゼおよびシトルリンの共局在によって示されています。

精製好中球と低密度好中球の両方が、PMA処理後に類似の動態学と量を持つNETを放出しました。当プロトコルは、高度に純度が高く機能的な低密度好中球を迅速かつ再現性のある方法で得ます。私たちは、低密度好中球をヒト血液から分離するための標準化され、時間効率の良いプロトコルが存在しない問題に取り組みます。

このプロトコルは複雑な機器に対して特別な訓練を必要としず、FACSよりも経済的で高速です。