ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹（MES）細胞のin vitroにおける分化

幹細胞は、体内の多種多様な細胞へと分化するという驚異的な能力を持っており、一種の身体修復システムとして機能します。理論的には、無限に分裂して他の細胞を補充することが可能です。

幹細胞が分裂すると、それぞれの新しい細胞は、幹細胞のままで留まるか、あるいはより特化した機能を持つ別の種類の細胞になるかのいずれかの可能性を持ちます。この有望な科学分野により、研究者は疾患を治療するための細胞ベースの治療法のin vitroでの可能性を調査しています。胚性幹細胞の分化は、細胞を浮遊培養中で凝集させることで起こります。

マウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞および白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor）が存在しない環境下で、これらの細胞凝集塊は胚様体と呼ばれます。吊り滴法（hanging drop method）は、幹細胞をin vitroで胚様体へと分化させるための有効な手法の一つです。こんにちは。スタンフォード大学心血管医学部門のSha Juanです。

本日は、ハンドドロップ法を用いた胚性幹細胞から胚体への個別の分化誘導手順をご紹介します。通常、この方法は胚性幹細胞を心筋細胞に分化させるために使用されます。この手順には、胚性幹細胞の単一細胞懸濁液の調製、ハンドドロップ培養の作製、ハンドドロップ培養から超低接着プレートへの移行、および胚体のjutコートプレートへの播種というステップが含まれます。

それでは、始めていきましょう。本手順の最初のステップは、胚性幹細胞の単一細胞懸濁液を調製することです。未分化の胚性幹細胞をマウス胚性線維芽細胞上で培養しているため、細胞を剥離させ、線維芽細胞から分離させる必要があります。

この操作を行うため、標準的な手順に従って細胞をトリプシン処理します。トリプシン処理が完了したら、マウス胚性幹細胞培地を加えてトリプシンを中和させます。次に、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。

次に、チューブの底でピペッティングを繰り返し、目に見える塊がない均一な細胞懸濁液になるまで細胞コロニーを分散させます。その後、細胞を1,000 RPMで5分間遠心分離します。遠心後、上清を吸引し、10 mLのマウスES細胞培地で細胞を再懸濁します。

細胞懸濁液を0.1% gelatinでコーティングしたT 75フラスコに移し、37°C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。1時間後、線維芽細胞はプレートに接着しますが、幹細胞は培地中に留まります。ピペットで培地を回収し、幹細胞を集めます。

細胞を1,000 RPMで5分間遠心分離し、培地を吸引して除去します。次に、分化培地をさらに10 mL加え、細胞が均一な懸濁液になるまで繰り返しピペッティングして再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。

これで、吊下滴法（ハンギングドロップ法）を用いて細胞懸濁液を培養する準備が整いました。吊下滴培養を開始するには、分化培地を使用して幹細胞懸濁液を20 µLあたり500個の細胞濃度に希釈します。次に、150 mm組織培養プレートの蓋を裏返します。

次に、細胞懸濁液 20 µL をプレートカバーの内表面にピペッティングします。マルチチャンネルピペッターを使用して、プレート上に 10 mL の PBS を加えます。素早くプレートカバーを反転させ、プレートの上に静かに置いて、吊垂滴（ハンギングドロップ）を形成させます。

プレートカバーを装着したら、慎重にプレートをインキュベーターに移して培養します。2日間、細胞を静置してください。インキュベーションが完了後、ハンギングドロップ培養物を超低接着プレートに転移させます。

2日後、プレートカバーを慎重に裏返し、新鮮な分化培地を180 µL吸引し、96ウェル超低接着プレートに数滴ずつ滴下します。次に、ピペットでそれらの液滴を吸い上げ、96ウェルプレートへ1つずつ移します。プレートをインキュベーターに入れ、3日間静置します。

胚体は引き続き球状に成長します。インキュベーションが完了すると、胚体をプレートに播種する準備が整います。これは、胚体の分化をさらに促進させるためです。

これらをゼラチンコート済みの48ウェルプレートに移します。まず、プレートの各ウェルに0.1%ゼラチンを300 µLずつコーティングします。ゼラチンを添加した後、プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。

翌日、48ウェルプレートからゼラチンを吸引して除去します。その後、各ウェルに分化培地を300 µLずつ加えます。次に、胚体を96ウェルプレートからゼラチンコートした48ウェルプレートへ1つずつ移します。

通常、細胞を維持するために、翌日、その後は1日おきに培地を交換します。私たちは、胚性幹細胞を分化させるためのより優れたプロトコルを探索するためにこの手法を用いています。心筋細胞に関しては、ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹細胞のin vitro分化誘導の手順を説明しました。

この手法が有効なのは、ハンギングドロップの底が丸いことで胚性幹細胞の凝集が促され、胚様体（Embry bodies）の形成に適した環境が提供されるためです。この手順を行う際は、初期細胞懸濁液中の細胞数を変えることで、ハンギングドロップ内に凝集させる胚性幹細胞の数を制御できる点に留意することが重要です。以上です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。