運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

本手順の全体的な目的は、マウス胚性幹細胞を運動ニューロンへと分化させることです。まず、マウス胚性幹細胞をマウス一次胚性線維芽細胞上で培養し、白血病抑制因子を添加します。次に、noggin、BFG F、およびFGF8を添加して神経分化プロセスを促進します。その後、レチノイン酸およびSmoothenedアゴニストとともにインキュベートすることで運動ニューロンへの特定を誘導し、続いて軸索伸長と運動ニューロンの成熟を行います。

最後に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、強いGFP蛍光を発現している分化したMES細胞を観察します。大量の運動ニューロンを生成できるようになったことで、既存のプロトコルと比較して、運動ニューロン疾患の研究が促進されました。マウス胚性幹細胞を運動ニューロンへと分化させるこの手法は、より効率的です。この方法は、脊髄性筋萎縮症に関する知見を提供することができます。

これは、筋萎縮性側索硬化症などの他の運動ニューロン疾患にも適用可能です。マウス初代胚性線維芽細胞を播種するために、100 mmの組織培養ディッシュ4枚に、0.1%ゼラチン溶液を8 mLずつコーティングします。室温で30分後、余分な液体を除去してください。次に、mitomycin Cで処理したPMEFの1バイアルを40 mLのPMEF培地で希釈し、4枚のプレートに播種して最大1週間培養します。

次に、MES細胞1バイアルを37°Cのウォーターバスで解凍します。15mLチューブ内で、細胞を5mLのE ES培地で洗浄します。その後、800 RPMで5分間遠心分離します。

上清を吸引し、新鮮な白血病抑制因子を添加したES培地20 millilitersでMES細胞を再懸濁します。PMEF培養液から10 millilitersの培地を除去し、代わりにHBG 3 ES細胞懸濁液10 millilitersを加えてください。播種後24時間目の小さなコロニーから、72時間後の直径約100 micrometersのコロニーに至るまで、MES細胞の経過を観察します。

MES細胞の誘導に向けて細胞の増殖を維持するため、培地を毎日交換します。その後、運動ニューロンへと分化させます。マウス胚性幹細胞は、まずPMEFフィーダー細胞から分離し、誘導当日に浮遊環境で培養する必要があります。

100 mmのES細胞培養につき、0.1%ゼラチンでコーティングしたT25フラスコを1個用意します。室温で30分後に、余分なゼラチンを除去し、PBSで3回洗浄します。ES細胞培養から、ゆるく付着しているコロニーを剥がさないように注意しながら、培地を慎重に吸引し続けます。その後、10 mLのPBSで1回洗浄します。

次に、MES細胞をPMEFから分離するため、0.25% trypsin EDTAを3 mL加え、3～5分間インキュベートします。37 °Cで、幹細胞とPMEFがプレートから剥離したことを確認します。その後、新鮮なES培地を15 mL加え、ピペッティングによりコロニーを分散させます。

細胞懸濁液を調製済みのゼラチンコートT150フラスコに移し、PFSがゼラチン化表面に付着するように37 °Cで30分間インキュベートします。次に、浮遊しているMES細胞を50 mLチューブに回収し、遠心分離によりペレット化します。細胞を10 mLの神経分化培地で再懸濁します。

ヘモサイトメーターを用いて培地中の細胞数を算出し、分化のために100 mmの懸濁培養皿に播種します。1日目に、顕微鏡観察によりMES細胞が胚様体と呼ばれる小さな浮遊凝集体を形成していることを確認します。皿に付着している可能性のあるPMEFを除去するため、ES懸濁細胞と培地を15 mLチューブに移し、500 RPMで3分間遠心分離します。

胚体（ebs）を回収するため、培地を慎重に吸引し、ペレット状になったebsに新鮮な神経分化培地を10 milliliters加え、その後、細胞を新しい細菌培養皿に播種し、分化条件下で24時間培養します。2日目、培養皿を軽く回して混ぜ、培地とEBSを15 milliliterチューブに移します。EBSを重力で沈降させた後、培地を慎重に吸引し、10 millilitersの運動ニューロン分化培地でEBSを再懸濁します。

分化過程において、新しい細菌用ディッシュでEBSを5日間培養します。7日目に、EBSの直径が約150から200 micrometersであり、分化に伴い強いGFP信号を発現していることを確認します。EBSを分散させる2日前となる5日目に、24ウェルプレートの底に12 millimeterの円形カバーガラスを配置します。

次に、100 µg/mL の poly DL ornithine を 0.5 mL 加え、4 °C で一晩インキュベートします。組織培養フード内で、poly DL ornithine を吸引し、プレートとカバーグラスを風乾させます。プレートのウェルを二回蒸留水で 3 回洗浄します。

カバーガラスをコーティングするため、そのまま風乾させます。氷冷した1 XPBS 5 mLに、2 µg/mLとなるようにマウスlamininを新たに希釈します。各ウェルに0.5 mLずつ添加し、4 °Cで一晩インキュベートします。

分化後、PBSで2回洗浄します。7日目に、EBSを15 mLチューブに回収し、重力で沈降させます。PBSで4回洗浄した後、1 mLのACU maxをEBSに加え、静かに混ぜて室温で5分間インキュベートし、その後、EBSを覆っている余分なACU maxを吸引します。

次に、3 mLのMND培地を加え、1 mLのマイクロピペットを用いて約20回ピペッティングし、EBSを分散させます。室温で2分間インキュベートした後、細胞懸濁液をセルストレーナーキャップを通して12 × 75 mmチューブに回収します。フィルターで保持された残りの凝集塊や細胞に対してもこの分散操作を繰り返し、最終的に6 mLの単一細胞懸濁液として単一細胞の回収率を高めます。単一細胞懸濁液を穏やかに混合し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。完全MND培地を用いて、細胞密度を2 × 10⁵ cells/mLに調整して播種します。

poly DL-ornithineおよびラミニンでコーティングしたカバーガラスが入った調製済みの24ウェルプレートの各ウェルに、0.5 millilitersの細胞懸濁液を分注します。分化後の細胞は、2日後に長い神経突起を伸ばします。培養において、HBG3は、運動ニューロン特異的プロモーターであるHB9の制御下でEGFPを発現する遺伝子組み換えマウス由来のES細胞株であり、規定の分化プロトコルを用いています。

MES細胞は、運動ニューロンを誘導するために使用できます。未分化のMES細胞は、線維芽細胞フィーダー層の上で円形のコロニーを形成します。これらの細胞は弱いGFP発現を示します。

これらのMES細胞をフィーダー層から分離し、低接着ディッシュで培養して胚様体を形成させた。分化したMES細胞は、7日目以降に強いGFP蛍光を示した。分化したEBsを解離し、poly DL-ornithineおよびラミニンでコーティングしたプレートに播種した。

分化した細胞は、培養2日後に播種した細胞の細胞体から長いニューライトを伸長させ、MES細胞由来の運動ニューロンは免疫蛍光染色によって特徴付けることができます。これらのGFP陽性細胞は、汎ニューロンマーカーであるニューロフィラメントと、2つの運動ニューロン特異的マーカーを発現しています。これらはEyelid oneおよびコリンアセチルトランスフェラーゼであり、合わせてDPIで核を染色します。

本研究の2段階分化プロトコルは、MES細胞を脊髄運動ニューロンへ分化させる効率的な手法を提供します。このビデオを視聴することで、マウス胚性幹細胞を運動ニューロンへ効率的に分化させる方法を理解できるはずです。結論として、運動ニューロンを効率的に生成するためには、マウス胚性幹細胞の品質が高いことが最も重要なパラメータであるという点に留意してください。