로블롤리 파인 PtGen2 cDNA Microarray 처리

이 영상은 조지아 대학교 워넬 임학 및 천연자원 대학의 연구진에 의해 제작되었습니다. 본 교육 영상의 목적은 LOB lolly pine pt, gen two CDNA 마이크로어레이의 처리 과정을 상세히 설명하는 것이며, 특히 하이브리드화 전후의 어레이 세척 및 취급 방법에 중점을 둡니다. 일반적으로 당사의 프로토콜은 유전체 연구소(TIGR)와 어레이 인쇄처인 밴더빌트 마이크로어레이 공유 자원 시설(VMSR)에서 개발한 절차를 따릅니다.

PT Gen two의 신호 품질의 균일성과 낮은 배경값을 통해 최대의 일관성을 확보하기 위해서는 더 엄격한 처리 과정이 필요하다는 것을 확인하였습니다. 첫 번째 단계는 사전 세척입니다. 스팟팅 버퍼의 염 농도가 매우 높기 때문에, 이를 제거하기 위해 사전 세척 과정이 필수적입니다.

슬라이드를 현미경 슬라이드 캐리어에 넣고 43°C로 예열된 0.2% SDS 용액에 15~20회 강하게 침지합니다. SDS 용액에서 슬라이드를 세척한 후, 핀셋을 사용하여 전-잡종화 완충액(pre hybridization buffer)이 담긴 Copeland jar로 조심스럽게 옮깁니다. 이 완충액은 5X SSC, 0.1% SDS 및 1% BSA를 포함하며, 마찬가지로 43°C로 가열합니다.

Copeland jar를 파퓸(parfum)으로 덮고 43°C 인큐베이터에서 1시간 동안 보관합니다. 전하이브리다이제이션(pre-hybridization) 후, 슬라이드를 현미경 슬라이드 캐리어로 옮기고 탈이온수로 5회 연속 세척하며, 각 세척 시 15~20회씩 담근 후 꺼내기를 반복합니다. 마지막으로, 슬라이드를 이소프로판올(isopropanol)에 넣고 5~6회 담근 후, chip M mate 원심분리기로 원심분리하여 완전히 건조시킵니다.

원심분리 후, 0.2 micron 필터를 통과한 압축 공기로 슬라이드를 불어 건조합니다. 그다음 압축 공기로 세척한 리프터 슬립(lifter slip)을 슬라이드 위에 덮고, 작은 피펫 팁을 사용하여 리프터 슬립이 슬라이드 위의 정확한 위치에 오도록 조정합니다.

리프터 슬립(lifter slip)을 배치한 후, 하이브리다이제이션 버퍼를 추가하기 전에 챔버 양 끝에 위치한 습도 웰에 100 millimolar dihi, three atol 20 µL를 추가합니다. 이제 하이브리다이제이션 버퍼에 재현탁된 타겟 cDNA를 추가할 준비가 되었습니다. 피펫 팁을 리프터 슬립과 슬라이드 가장자리에 놓고 용액을 천천히 피펫팅합니다.

모세관 현상을 이용하여 어레이에 샘플을 로딩하는 것이 가장 일관성이 높으며, 원치 않는 기포의 유입을 크게 줄일 수 있음을 확인하였습니다. 표적 물질을 어레이에 첨가한 후, 하이브리다이제이션 챔버를 조립하고 알루미늄 호일로 덮습니다. 그다음 하이브리다이제이션 챔버를 진탕 수조에 넣고 일반적으로 14~16시간 동안 하룻밤 동안 배양합니다.

항온수조는 48°C로 설정하고 셰이커는 50 rpm으로 설정합니다. 또한, 하이브리다이제이션 용액을 첨가하는 시점부터 모든 하이브리다이제이션 후 세척 단계까지, 광산화를 방지하기 위해 모든 과정은 약한 조명 하에서 수행해야 한다는 점이 중요합니다. 다음 날, 슬라이드를 하이브리다이제이션 챔버에서 꺼내 53°C로 예열된 1번 세척 용액이 담긴 코플랜드 자(Copeland jar)에 넣습니다.

슬라이드를 리프터 슬립이 떨어져 나갈 때까지 코플랜드 자(Copeland jar)에 약 1분 동안 그대로 둡니다. 그 후 핀셋을 이용해 슬라이드를 조심스럽게 꺼내 현미경 슬라이드 캐리어에 옮겨 세척 과정을 진행합니다. 그다음, 53°C의 1번 세척액이 들어 있는 두 번째 용기에 슬라이드를 넣고 약 15~20회 정도 강하게 흔들어 줍니다. 용기를 파라필름(parafilm)으로 덮은 뒤, 53°C 및 100 RPM으로 설정된 인큐베이터 에어 셰이커에 넣습니다.

10분간의 배양과 세척액 1번 처리 후, 슬라이드를 실온 상태인 세척액 2번이 담긴 용기에 15~20회 격렬하게 담갔다 뺍니다. 용기를 파라필름으로 덮고 다시 실온의 쉐이커 위에 올려 10분간 배양합니다. 마지막으로, 슬라이드를 세척액 2번에서 꺼내 세척액 3번이 담긴 용기에 15~20회 격렬하게 담갔다 뺍니다.

그 후 슬라이드를 파라필름으로 덮인 세 번째 세척액이 담긴 두 번째 용기로 옮기고, 다시 셰이커에 올려 10분 동안 반응시킵니다. 최종 세척 후, 슬라이드를 완전히 건조시키기 위해 원심분리를 수행합니다. 이를 위해 50 mL 원추형 튜브 안에 15 mL Falcon 캡을 넣고, 바코드 면이 아래로 향하게 하여 어레이를 원추형 튜브에 넣습니다.

그 다음 튜브를 스윙 버킷 로터가 장착된 원심분리기에서 실온, 1500 RPM으로 회전시킵니다. 원심분리가 끝나면 슬라이드를 알루미늄 호일로 감싼 또 다른 50 mil 원추형 튜브 세트로 옮깁니다. 그런 다음 0.22 micron 필터로 여과된 질소 가스로 튜브 내부를 퍼지하고, 운송 또는 스캐닝 전까지 보관할 수 있도록 캡을 닫습니다.

PerkinElmer scan array 5,000을 사용하여 스캔 데이터를 수집합니다. 어레이 이미지를 그리드로 나누고, Bio Discovery의 이미징 소프트웨어 제품군을 사용하여 원시 스캔 데이터를 처리하고 초기 데이터 분석을 수행합니다. 다음으로, 국립암연구소(National Cancer Institute)에서 다운로드할 수 있는 강력하고 무료로 제공되는 마이크로어레이 통계 패키지인 BRB array tools를 사용하여 스팟 신호 강도 데이터를 정규화하고 통계 분석을 수행합니다.

기타 통계 분석 및 유전자 발현 패턴 검색은 무료로 이용 가능한 또 다른 웹 기반 분석 패키지인 유전자 발현 패턴 및 분석 스위트 Jeep PPAs를 사용하여 수행합니다. lob lolly pine PT Gen two 마이크로어레이 처리 방법에 관한 영상을 시청해주셔서 감사합니다.

다음의 인원들이 본 교육 영상의 내용 구성 및 제작을 담당하였습니다.