전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

본 프로토콜을 통해 효모 지질 층의 주요 성분을 빠르게 분석할 수 있습니다. 먼저 효모 세포를 수확하고 세척하는 과정으로 시작합니다. 세척된 세포를 클로로포름과 메탄올을 1:2 비율로 혼합한 용액에 넣고 유리 비드로 용해시킵니다.

클로로포름과 물을 첨가하여 두 상을 분리합니다. 유기상을 수집하여 건조시킨 후, 질량 분석 전 보관을 위해 지질 막을 클로로포름에 녹입니다. 추출된 지질을 암모늄 하이드록사이드가 포함된 클로로포름과 메탄올에 희석하고, 내부 표준물질 혼합물을 첨가합니다.

이제 지질 용액을 질량 분석기에 직접 주입할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 콩코르디아 대학교 생물학과 블라디미르 테코 연구실의 사이먼 보크입니다. 오늘은 질량 분석법을 이용하여 효모 지질을 정량하는 방법을 보여드리겠습니다.

본 실험실에서는 다양한 성장 조건에 따른 효모 지질의 변화를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 이전에 준비한 냉동 효모 펠릿을 1.6 milliliters의 ice-cold 증류수에 재현탁하고, 세포 현탁액 1.6 milliliters를 고속 유리 원심분리 튜브로 옮깁니다.

이 절차 전반에 걸쳐 추출된 지질을 다루는 모든 조작은 유리 피펫이나 주사기를 사용하여 수행해야 합니다. 플라스틱은 강한 배경 신호를 생성하므로, 플라스틱이 클로로포름과 접촉하지 않도록 주의하십시오. 세포 현탁액에 1:2 비율의 클로로포름-메탄올 혼합액 6mL와 유리 비즈 0.8mL를 에이노르 튜브(einor tube)에 넣어 추가하여 지질 추출을 시작하십시오. 클로로포름, 메탄올, 물에 현탁된 효모의 비율이 1:2:0.8로 유지된다면 정확한 부피는 중요하지 않습니다. 볼텍싱하십시오.

세포 현탁액과 유리 구슬을 1분씩 두 번 혼합한 후, 2 mL의 클로로포름을 추가하고 부드럽게 혼합한 다음 상온에서 가끔씩 섞어주며 5분 동안 배양합니다. 5분간의 배양 후, 2 mL의 증류수를 추가하고 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 다시 상온에서 가끔씩 섞어주며 5분 동안 배양합니다.

여기에서도 특정 부피보다는 클로로포름, 메탄올, 물의 비율을 2:2:1.8로 유지하는 것이 더 중요합니다. 두 번째 배양이 완료되면, 상온에서 3000 Gs로 5분간 원심분리하고, 이 1차 추출물에서 상층액을 모두 새 고속 유리 원심분리 튜브에 수집한 후, 남은 세포 펠렛에 3.2 mL의 클로로포름을 첨가하여 2차 지질 추출을 수행합니다.

클로로포름을 첨가한 세포 펠렛을 1분씩 두 번 볼텍싱합니다. 그런 다음 3000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 실온에서, 이 두 번째 추출의 상층액을 첫 번째 추출 후 수집한 상층액에 추가합니다. 다음으로 수집된 상층액을 5분 동안 원심분리합니다.

실온에서 3000 Gs로 원심분리하면 추출된 지질이 하층의 유기층에 용해됩니다. 상층의 수성층은 버리고 하층의 유기층을 새로운 고속 유리 원심분리관으로 옮깁니다. 질량 분석기에서 더 깨끗한 스펙트럼을 얻으려면, 유기층을 실온에서 3000 Gs로 5분 동안 원심분리한 후 상층액 전체를 유리 바이알로 옮깁니다.

용해된 지질을 질소 기체 하에서 건조시키고, 건조된 지질 필름을 500 µL의 클로로포름에 녹인 후 질량 분석법으로 시료를 분석할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오. 동봉된 서면 프로토콜의 표 1에 나열된 대로 클로로포름 내 지질의 표준 혼합물을 준비하는 것부터 시작하십시오. 각 지질은 서로 다른 클래스를 나타냅니다.

이 용액은 추출된 지질을 질량 분석기에 주입하기 전까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 샘플 10 µL와 지질 표준 혼합물 10 µL를 혼합하십시오. 표준물질 대 샘플의 비율은 필요에 따라 변경할 수 있음에 유의하십시오.

분당 1 µL의 유량으로 작동하는 나노 일렉트로스프레이 소스가 장착된 micro mass Q to F two 질량 분석기를 사용하여 샘플과 표준 지질 혼합물을 분석합니다. 세부 설정은 동봉된 서면 프로토콜의 표 2에 상세히 설명되어 있습니다. Q to F 질량 분석기의 고해상도를 활용하는 것이 유리하지만, 이는 필수 요구 사항은 아닙니다.

정확한 기기 파라미터는 질량 분석기마다 다를 수 있습니다. 데이터 수집 후, 질량 스펙트럼을 평활화하고 배경값을 뺀 다음 피크의 중심을 맞춥니다. 마지막으로, 피크 목록을 excel로 내보냅니다.

그 후 각 지질 클래스의 피크를 내부 표준물질에 맞게 정규화합니다. 응용 분야에 따라 디아이소토프(de isotope) 및 디컨볼루션(deconvolution)과 같은 추가적인 후처리가 필요할 수 있습니다. 이 방법을 통해 효모 지질 옴(lipidome)의 주요 성분을 신속하고 심층적으로 결정할 수 있습니다.

여기에서는 동위원소 디콘볼루션(deconvolution) 및 내부 표준물질로 정규화 과정을 거친 하나의 지질을 강조하여 표시했습니다. 지금까지 효모 지질을 분리하는 방법과 전기분무 이온화 질량분석법(electrospray ionization mass spectroscopy)을 사용하여 효모 지질을 결정하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 플라스틱 사용을 피하고 시료를 농도의 선형 범위 내로 유지하는 것이 중요합니다.

이 방법은 상당히 유연하며 많은 부피를 필요에 따라 변경할 수 있습니다. 이 추출 프로토콜은 박층 크로마토그래피 및 다차원 질량 분석법과 같은 다른 지질 분석 방법에도 적합합니다. 이것으로 모두 끝났습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.