펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

다음 절차의 전반적인 목표는 복잡한 혼합물 내에서 각 단백질의 대리물로 작용하는 펩타이드를 분리하고 정량하는 것입니다. 우선, trypsin과 같은 효소를 사용하여 혼합물 내의 거대 단백질을 구성 펩타이드로 소화시킵니다. 그 다음, 표적 펩타이드 분석물과 스파이킹된 안정 동위원소 표지 내부 표준물을 항-펩타이드 항체를 사용하여 농축하며, 분리 후에는 단백질 G가 코팅된 자기 입자에 고정시킵니다.

표적 펩타이드를 자성 입자로부터 용출시킨 후, 질량 분석법을 통해 내부 표준물질 대비 정량을 분석합니다. 기존의 전통적인 면역 분석법과 같은 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 다수의 분석법을 구축할 때 더 빠르고 비용 효율적이라는 점입니다. 또한 성공률이 높고 다중 분석(multiplexing)이 용이하며, 본 절차를 통해 그 과정이 상세히 제시될 것입니다.

실험실 기술자가 젖은 얼음 위에 10 µL의 혈장 용액을 준비합니다. 샘플을 1000 µL 딥웰 플레이트로 옮기고 파라필름으로 덮어 단백질을 변성시킵니다. 각 샘플에 20 µL의 신선한 9 M urea와 30 mM DTT를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 각 샘플에 3 µL의 신선한 500 mM iodoacetamide를 첨가하고 상온의 암실에서 30분 동안 배양합니다. 이제 100 mM tris pH 8을 사용하여 urea 농도를 0.6 M로 희석하고, 효소 대 기질 비율을 1:50으로 맞추기 위해 1 µg/µL trypsin 표준 용액 10 µL를 첨가합니다.

순수 formic acid 3 µL를 최종 농도 1%가 되도록 첨가하여 37 °C에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 안정 동위원소 표준물질 또는 여러 표준물질을 계속해서 첨가합니다. 멀티플렉스 분석을 수행하는 경우, Oasis 카트리지 플레이트를 80% ACE nitrile에 녹인 0.1% formic acid 500 µL로 충분히 세척하고 통과액은 버립니다. 그런 다음, 물에 녹인 0.1% formic acid 500 µL를 첨가하여 카트리지 플레이트를 평형화하고 통과액을 버립니다.

소화된 샘플을 카트리지 플레이트에 로딩하고, 흐름이 매우 느려지도록 진공 상태를 조절합니다. 물에 희석한 0.1% formic acid 500 µL로 3회 세척한 후 통과액은 버립니다. 80% acetonitrile에 희석한 0.1% formic acid 500 µL로 펩타이드를 2회 용출합니다. 그 후 용출액을 동결 건조하거나 속건 건조하여 완전히 말린 다음, 0.03% Chaps가 첨가된 PBS 50 µL에 건조된 펩타이드를 재용해합니다. 샘플을 표준 Kingfisher 96웰 플레이트로 옮기고, 타겟당 1 µg의 항체와 1.5 µL의 Protein G 코팅 자성 비드를 추가합니다. 비드를 추가하기 전에 볼텍싱합니다.

비드가 충분히 부유되었는지 확인하십시오. 플레이트를 호일로 덮고 완만한 회전식 원심분리기를 사용하여 하룻밤 동안 배양하십시오. 플레이트를 400 RPM으로 10초 동안 원심분리하여 호일 표면에 묻은 액체를 제거하십시오.

호일 덮개를 제거합니다. 시료 조작은 자동화된 Kingfisher 플랫폼에서 수행합니다. 0.03% CHAPS가 포함된 PBS 200 µL로 비드를 2회 세척하고, 0.03% CHAPS가 포함된 PBS를 1:10으로 희석한 용액 200 µL로 1회 세척합니다. 이제 0.03% CHAPS가 포함된 5% acetic acid 25 µL를 사용하여 펩타이드를 용출합니다.

용출 플레이트를 자석 위에 놓고, 남은 비드를 옮기지 않도록 주의하며 용출액을 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 실링 매트로 덮은 후, 용출액이 담긴 이 플레이트를 분석을 위해 삼중 또는 사중 질량분석기로 전달합니다. MRM 방법은 관심 펩타이드의 탠덤 질량 스펙트럼을 얻은 다음, 최적의 전이 프래그먼트 이온을 선택하고 최적화함으로써 구축됩니다.

일반적으로 MRM 분석을 위한 구성에는 두 가지 이동상을 사용하는 C 18 트랩 및 분석 컬럼이 사용됩니다. 샘플 10 µL를 로딩하고 선형 기울기로 용출합니다. 경쇄 및 중쇄 펩타이드의 피크 면적을 적분하고, 각 샘플에서 비표지 펩타이드 대비 표지 펩타이드의 피크 면적 비율을 계산합니다.

경쇄 및 중쇄 펩타이드는 동시에 용출되며, 각 펩타이드에 대해 여러 전이를 모니터링할 수 있습니다. 정체성을 확인하기 위해 내인성 펩타이드의 피크 면적을 내부 표준물질의 면적과 비교하여 측정함으로써 표적 펩타이드의 정량적 수치를 제공합니다. 이 영상을 시청한 후에는 귀하의 실험실에서 이 기술을 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 관심 있는 모든 단백질을 정량화하는 데 사용할 수 있어 생물학 연구의 광범위한 응용 분야에 적합합니다.