Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

안녕하세요, 제 이름은 Brad Hamilton입니다. 저는 STEM Gen의 연구 개발 부서에서 근무하고 있는 과학자입니다. 오늘은 렌티바이러스를 통해 전달된 리프로그래밍 인자를 사용하여 인간 섬유아세포를 리프로그래밍하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 절차는 IPS 세포를 생성하고 리프로그래밍 과정을 연구하는 데 모두 사용될 수 있습니다. IPS 세포는 형태, 증식, 그리고 신체의 모든 조직 유형으로 분화하는 능력 면에서 ES 세포와 유사합니다. 인간 IPS 세포는 세포를 얻기 위해 배아를 파괴해야 하는 윤리적 딜레마 없이 ES 세포의 핵심 특성을 나타내므로 ES 세포보다 뚜렷한 장점이 있습니다.

환자 맞춤형 iPS 세포의 생성은 비자가 이식 세포의 면역 거부 반응 가능성을 제거함으로써 개인 맞춤형 재생 의학 치료의 중요한 장애물을 극복하게 해줍니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 프로토콜의 여러 단계에서, 발달 중인 iPSC 또는 유도만능줄기세포의 배지를 meth 조건화 배지로 교체하게 됩니다.

이 배지를 준비하는 데는 6일이 소요됩니다. 따라서 실험 시작 예정일로부터 최소 일주일 전에 준비를 시작하십시오. 먼저 6웰 플레이트의 각 웰에 시딩하십시오.

2 mL의 meth 성장 배지가 담긴 웰 플레이트에 2 × 10⁵ CFU의 meth 피더 세포를 넣고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 human E-S-I-P-S 세포 배양 배지로 교체합니다.

배지를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 4일 동안 24시간마다 상층액을 수집하고 새 배지로 교체합니다. 수집한 상층액을 0.22 µm 필터로 여과합니다.

수집한 상청액에 15 ng/mL의 BFGF (basic fibroblast growth factor)를 보충합니다. 그러면 약 16 mL의 meth conditioned medium이 생성됩니다. 매일 수집한 상청액은 4 °C에서 각각 별도로 보관하십시오. Meth conditioned medium은 4 °C에서 1~2주 동안, 또는 -20 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다.

이제 meth 조건 배지가 필요할 때 바로 사용할 수 있도록 준비되었으므로, 세포 준비에 대해 알아보겠습니다. iPSC 생성의 첫 번째 과제는 렌티바이러스를 사용하여 인간 포피 섬유아세포 또는 BJ 세포에 줄기세포의 특징인 4가지 전사 인자를 형질도입하는 것입니다. 형질도입을 준비하기 위해, 6웰 플레이트의 웰당 1×10⁵ cells 밀도로 BJ 세포를 분주하고 배양하십시오.

세포를 2 mL의 성장 배지에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 하룻밤 동안 배양합니다. 같은 날, 6-well 플레이트에 물로 희석한 0.1% gelatin 2 mL를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하여 meth feeder 플레이어 준비를 시작합니다. gelatin은 웰을 코팅하여 세포를 위한 매트릭스 역할을 합니다.

이제 BJ 세포를 렌티바이러스 형질전환에 사용할 준비가 되었으며, 형질전환을 위한 바이러스를 준비합니다. 2 mL의 신선한 배지에 6 µg/mL의 polybrene과 인간 전사 인자인 T4, SO2, nanog, lin28을 각각 발현하는 4종의 렌티바이러스를 각각 동일한 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)가 되도록 첨가합니다.

이 렌티바이러스들은 모두 인간 리프로그래밍 인자 렌티바이러스 세트에 포함되어 있습니다. 트랜스덕션을 수행하려면 BJ 세포 성장 배지를 바이러스가 포함된 배지로 교체하기만 하면 됩니다. 배지가 바닥면을 고르게 덮을 수 있도록 플레이트를 부드럽게 흔들어 줍니다.

같은 날 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 액체 질소에서 cf one meth feeder 세포가 담긴 바이알 하나를 꺼내 해동합니다. gelatin이 코팅된 meth feeder 플레이트에서 gelatin 용액을 제거합니다.

BJ 세포 0.2 × 10⁵개를 2 mL의 meth 성장 배지에 첨가합니다. 해당 배양액을 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 0.05% trypsin EDTA로 BJ 세포를 떼어낸 후 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.

원심분리 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 성장 배지로 재부유시킵니다. meth 피더 플레이트에서 배지를 제거하고, 웰당 2 mL의 BJ 세포 현탁액을 추가합니다. BJ 세포의 농도는 웰당 약 5 × 10⁴ cells가 되어야 합니다.

37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. BJ 세포를 meth 피더 플레이트에 파종한 지 24시간 후에 배지를 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포 배양 배지인 human E-S-I-P-S로 교체합니다. 7일 동안 24시간마다 배지 교체를 계속합니다.

7일 차에, ES 세포 배양액을 2 mL의 meth 조건 배지로 교체합니다. meth 피더 세포는 iPS 세포 성장에 필요한 수용성 인자들을 제공해 왔습니다. 하지만 이제 배양 상태를 건강하게 유지하기 위해 이러한 인자들을 더 추가해야 합니다.

Meth 조건 배지는 37°C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양한 meth feeder cell에서 분비된 모든 수용성 인자를 포함하고 있습니다. 현미경을 통해 세포 콜로니를 선택합니다. 24시간 전에 ccf one meth feeder cell을 미리 도말한 새로운 24-well plate에서 작고 조밀한 돔 모양으로 구분되는 콜로니를 선택하여 human E-S-I-P-S 배양액으로 회수합니다.

10 µM의 stem molecule Y 2 7 6 3 2가 첨가된 배지. 이는 dependent kinase 억제제입니다. 처음 7일 동안은 24시간마다 stem molecule Y 2 7 6 3 2를 첨가하지 않은 새 배지로 교체하십시오.

7일 후, 배지를 meth. Condition 배지로 교체하십시오. 세포가 전형적인 인간 ES 세포 형태를 보일 때까지 계대 배양을 계속하십시오. 경계가 뚜렷하고 작고 조밀한 돔 형태의 콜로니가 형성되는지 확인하십시오.

콜로니는 균일해야 하며 세포질 대비 핵의 비율이 높아야 합니다. 이 단계에서 ES 세포의 형태를 가진 콜로니를 배양했지만, ES 세포의 특성 유전자 또한 발현하고 있는지 확인해야 합니다. 이를 확인하기 위해 TRA 180, TRA 1 60, SSEA 4, SSEA 3, T 4, sox 2, nanog 및 SSEA 1과 같은 다능성 마커로 콜로니를 염색하십시오. 먼저 PBS로 세포를 부드럽게 3회 세척합니다.

다음으로, 500 µL의 4% paraformaldehyde 또는 다른 고정액을 사용하여 상온에서 20분 동안 세포를 고정합니다. 20분 후, PBS로 세포를 3회 더 세척하여 과잉 고정액을 제거합니다. 이어서, 웰당 500 µL의 블로킹 버퍼(blocking buffer) 내에서 상온에서 1시간 동안 세포를 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다. 블로킹 단계 후, 블로킹 버퍼에 1:100으로 희석한 1차 항체 250 µL를 각각 추가합니다.

세포를 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날, 결합하지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 1:300으로 희석한 2차 항체 250 µL와 블로킹 버퍼를 사용하여 세포를 상온에서 1시간 동안 배양하며, 2차 항체 배양 후 광퇴색을 방지하기 위해 빛이 닿지 않도록 보관합니다.

세 번째 세척 단계까지 PBS로 세포를 세 번 세척하십시오. 핵을 염색하기 위해 1 µg/mL 농도의 DPI를 첨가하십시오. 마지막으로, IPS 세포의 유전자 발현을 분석하십시오.

현미경 하의 형태학적 결과에서, T4, SOX2, Nanog 및 Lin28이 공동 형질전환된 인간 피부 섬유아세포에서 형태학적 변화가 형질전환 후 이르면 4일 차에 관찰되었으며, 17일 차에는 세포 군집이 더 조밀하게 뭉쳤습니다. 분화능 마커의 발현을 확인하였습니다. 분리된 iPS 세포 콜로니의 특성을 추가로 규명하기 위해, ES 세포에서 발현되는 공통적인 분화능 마커의 존재 여부를 확인하였습니다. 콜로니는 강한 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 활성을 나타냈습니다.

또한, 표면 마커인 TA 180, TRA-1-60, SSEA-4 및 SSEA-3와 핵 마커인 OCT4, SOX2 및 Nanog를 포함하는 다능성 마커 특이적 항체 패널을 사용하여 iPS 세포 콜로니에 대해 면역화학 염색 또는 ICC를 수행하였습니다. 분리된 iPS 콜로니는 모든 마커에 대해 양성 반응을 보였습니다. ICC 결과는 iPS 세포가 적절한 다능성 마커 발현 패턴을 나타냈음을 보여주며, 이는 이 iPS 세포들이 분화되지 않은 인간 ES 세포와 매우 유사함을 입증합니다.

지금까지 stem gen을 사용하여 인간 섬유아세포를 리프로그래밍함으로써 IPS 세포를 생성하는 방법을 살펴보았습니다. 인간 리프로그래밍 인자 렌티바이러스 세트입니다. 이 절차를 수행할 때는 몇 가지 요소를 고려하는 것이 중요합니다.

첫째, 최적의 형질전환 효율을 달성하기 위해 1차 형질전환 단계에서 활성 바이러스 대 타겟 세포의 비율을 수정해야 할 수 있습니다. 둘째, 타겟 세포의 성장 조건이 영향을 미칠 수 있습니다. 건강하고 증식 능력이 있는 세포를 재프로그래밍하는 것이 더 용이합니다.

셋째, 서로 다른 세포 수에 맞춰 프로토콜을 수정할 때는 배양 접시의 표면적에 비례하여 목표 세포 수를 조정하는 것이 권장됩니다. 마지막으로, 최근 연구에서 Y 2 7 6 3 2와 같은 rock 억제제가 인간 iPS 세포 콜로니의 생존율을 높이는 데 유용함이 입증되었으므로, 성공적인 리프로그래밍을 위해 이를 적용하는 것을 고려해야 합니다. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.