인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

본 비디오 논문에서는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 성인 인간 섬유아세포를 역분화시켜 다능성 줄기세포를 생성합니다. 먼저, 전사 인자인 T three four, SOX two, KLF four 및 cmic을 인코딩하는 레트로바이러스 벡터를 인간 섬유아세포에 형질도입합니다.

감염된 섬유아세포를 마우스 배아 공급세포 위에서 14~28일 동안 배양합니다. 생성된 배양물은 리프로그래밍된 세포 군집을 식별하기 위해 TRA 180 1 항체로 염색합니다. 이후 양성 군집을 확장을 위해 MEF가 포함된 플레이트로 옮깁니다.

면역세포화학 염색을 통해 다능성 마커의 발현과 다능성 줄기세포주 구축을 확인합니다. 이후 세포주의 특성을 추가로 규명하기 위해 추가 연구를 수행해야 합니다. 일반적으로 체세포 리프로그래밍 및 인간 유도 다능성 줄기세포 배양에 익숙하지 않은 연구자는 적절한 iPSC 콜로니를 식별하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.

본 절차는 저희 실험실의 박사후 연구원인 Sula Pollak 박사가 시연하겠습니다. 먼저 Phoenix AM FO 세포를 10 cm 플레이트당 약 700만에서 800만 개의 밀도로 10 mL의 high glucose DMEM에 분주하여 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, T34SOX, 2KLF, 4CMIC 또는 GFP 유전자를 인코딩하는 벡터 12 µg과 Fugene 6 35 µL를 L-glutamine이 포함된 serum-free high glucose DMEM 총 500 µL에 혼합하여 transfection 혼합물을 준비하십시오.

혼합물을 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 phoenix 세포를 형질전환시키기 위해, 70~80% 정도 합류(confluent)된 phoenix 세포가 담긴 플레이트에 DNA 복합체를 조심스럽게 피펫으로 분주합니다. 6~8시간 후 세포를 37 °C에서 배양합니다.

배지를 흡입하여 제거하고 항생제가 포함된 8 mL의 고농도 포도당 DMEM으로 교체합니다. 그런 다음 배양기에서 12시간 동안 추가 배양합니다. 피펫을 사용하여 바이러스가 포함된 배지를 흡입하여 수집합니다.

그 후 배지를 교체하고, 배지를 총 4회 수집할 때까지 이 과정을 12시간마다 반복합니다. 수집한 배지는 4 °C에서 보관합니다. 모든 배지가 수집되면 각 분액을 모두 합친 다음, 0.45 µm 튜브 탑 필터를 통해 50 mL 원심 분리관에 걸러 탈락된 세포와 잔해물을 제거합니다.

바이러스 입자가 포함된 여과된 배지는 감염 활성을 유지하면서 냉장고에 2주 동안 보관할 수 있습니다. 냉동 보관은 권장되지 않습니다. 형질전환 절차 전날, 냉동 보관된 성인 인간 섬유아세포 스톡을 해동하여 젤라틴 코팅된 6-well 플레이트의 각 웰에 1 × 10⁵ cells를 분주합니다.

다음 날 50 milliliter 원추형 튜브에 T four SOX two, klf four 및 cmic 바이러스 배지를 각각 3.5 milliliters씩 혼합하고, 대조군으로서 poly brain을 최종 농도 6 micrograms per liter가 되도록 첨가합니다. GFP 바이러스 배지 1 milliliter, 배양 배지 3 milliliters 및 최종 농도 6 micrograms per milliliter의 poly brain을 준비합니다. 인간 섬유아세포가 포함된 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다.

그 다음 4 mL의 혼합 바이러스 배지 또는 대조군 배지를 추가하고, 플레이트를 20 °C에서 1600 G로 1시간 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 플레이트를 약 12시간 동안 배양합니다. 그 후 바이러스 배지를 섬유아세포 배양 배지로 교체하고 다시 12시간 동안 배양합니다.

감염부터 섬유아세포 배지 배양까지의 이 과정을 마지막 감염 이후 두 번 더 반복합니다. 섬유아세포를 DMEM에서 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음, GFP 레트로바이러스 배지를 사용하여 병행 형질도입의 감염 효율을 확인합니다.

다음으로 체세포에서 다능성 세포로의 리프로그래밍을 개시합니다. 감염된 섬유아세포는 인간 배아줄기세포 배지 또는 HES 배지에서 배양합니다. 다음 날, 젤라틴 처리된 6-웰 플레이트에 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF를 웰당 약 2 × 10⁵ cells의 밀도로 섬유아세포 성장 배지에서 분주합니다.

0.05% trypsin EDTA를 사용하여 감염된 인간 섬유아세포를 분리하고, 섬유아세포 성장 배지에서 웰당 약 1.2 × 10⁴의 밀도로 분주합니다. 다음 날, 리프로그래밍 초기 7일 동안 0.5 mM sodium butyrate가 포함된 HES 배지로 배지를 교체합니다.

배지를 매일 교체하십시오. 배지를 sodium butyrate가 포함되지 않은 HES 배지로 교체하고, 7~21일 동안 리프로그래밍을 계속 진행하십시오. 매일 배지를 교체하십시오.

형질전환된 세포의 형태학적 변화를 확인하십시오. 형질전환된 섬유아세포를 피더 세포로 옮긴 후 약 10일이 지나면 세포 군집이 나타나기 시작합니다. 리프로그래밍된 세포를 포함하는 이 군집을 이제 인간 유도만능줄기세포 또는 인간 IPS 세포라고 합니다.

인간 iPS 세포 콜로니는 MEF 피더 세포 위에 플레이팅한 후 14~28일이 지나면 분리할 준비가 됩니다. 이 단계에서 인간 iPS 세포 콜로니는 MEF가 포함된 플레이트 또는 매트리젤(matrigel)이 코팅된 플레이트로 옮길 수 있습니다. 여기서는 인간 iPS 세포 콜로니를 픽킹하기 하루 전에 MEF가 포함된 플레이트로 옮기는 과정을 보여줍니다. 감마선 조사된 MEF 피더 세포가 담긴 24웰 플레이트를 섬유아세포 성장 배지에 배양합니다.

인간 iPS 세포 콜로니를 피킹하는 날에 37°C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. ME Fs에서 섬유아세포 성장 배지를 흡입하여 제거하고 PBS로 헹궈 FBS의 흔적을 모두 제거합니다. 이어서 10 µM의 rock 억제제 Y 2 7 6 3 2가 포함된 인간 배아 줄기 세포 또는 HES 배지 0.5 mL를 각 웰에 첨가합니다. 다음으로, 층류 후드에 설치된 현미경을 사용하여 리프로그래밍 플레이트에서 인간 iPS 세포 콜로니 형성을 확인합니다.

필요한 경우, 21 gauge 바늘을 사용하여 인간 IPS 세포 콜로니 주변의 섬유아세포를 제거하십시오. 플레이트를 PBS로 헹구고 TRA 180 1 생존 특이적 항체가 포함된 신선한 HES 배지를 추가하십시오. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기로 되돌려 놓으십시오.

30분 후, 배지를 10 micromolar rock inhibitor가 첨가된 신선한 HES 배지로 교체하십시오. 그 후 형광 현미경으로 콜로니를 관찰하십시오. TRA one에서 81까지 양성 콜로니를 표시하십시오.

21 gauge 바늘을 사용한 객관적 마커를 이용하여 TRA 180 1 양성 인간 IPS 세포 콜로니를 여러 개의 작은 조각으로 자릅니다. 다음으로, 자동 피펫을 사용하여 인간 IPS 세포 콜로니 조각들을 ME Fs가 포함된 24-well 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 이때 IPS 세포가 아닌 세포가 옮겨지지 않도록 주의하십시오.

플레이트를 인큐베이터에 넣고 인간 iPS 세포 콜로니가 24~36시간 동안 부착되도록 하며, 배지를 매일 교체합니다. 24-웰 플레이트로 처음 이식한 후 48시간이 지나면 올바른 HE 유사 형태를 가진 인간 iPS 세포 콜로니가 관찰됩니다. 6~8일마다 21 gauge 바늘로 콜로니를 절단하여 인간 iPS 세포 콜로니를 수동으로 계대 배양합니다. 클론 증식 후에는 12-웰 플레이트와 이어서 6-웰 플레이트로 배양 규모를 확장합니다.

인간 iPS 세포주를 구축한 후에는 면역화학법을 사용하여 다능성 마커인 TRA-1-60, SSEA-4, T3/4, SOX2 및 nanog의 발현을 분석합니다. 상세한 특성 분석에는 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo) 분화 분석, 핵형 분석, 외래유전자 침묵 분석, 메틸화 연구 및 유전자 발현 연구가 포함될 수 있습니다.

바이러스 트랜스덕션의 효율성을 결정하기 위해서는 레트로바이러스 포함 배지를 이용한 효율적인 트랜스덕션이 성공적인 리프로그래밍에 매우 중요합니다. Friedrichs ataxia 환자 유래 인간 성인 섬유아세포를 대상으로 GFP 레트로바이러스 배지를 이용해 두 번 연속 감염시킨 후 시각화하였습니다. 섬유아세포를 바이러스 배지와 단순 배양하여 감염시켰을 때 트랜스덕션된 세포는 20% 미만이었습니다. 그러나 GFP 레트로바이러스 배지를 첨가한 직후에 [특정 처리]를 수행하자 트랜스덕션 효율이 극적으로 증가하였습니다.

분리된 인간 IPS 세포 콜로니의 초기 특성 분석을 수행하기 위해, 여기서는 80% 이상의 세포가 형질전환되었습니다. 여기서 보여지는 바와 같이, 인간 ES 세포의 특징적인 다능성 마커의 발현을 면역화학법으로 평가하였습니다. 분리된 인간 IPS 세포 콜로니들은 다능성 마커에 대해 양성 반응을 보였습니다.

T 3/4, SOX 2, nano SSEA 4 및 TRA 1-60 DNA. 상단 패널에 표시된 DPI와의 공염색(Cos staining)은 인간 IPS 세포 군집과 피더 세포 모두에서 검출됩니다. 이러한 결과는 본 리프로그래밍 프로토콜을 통해 획득한 인간 IPS 세포가 미분화 인간 다능성 줄기세포의 특성인 적절한 다능성 마커를 발현함을 입증합니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 레트로바이러스 전달을 통해 인간 섬유아세포를 다능성 줄기세포로 성공적으로 역분화시키는 방법, 올바른 인간 유도 다능성 줄기세포 콜로니를 식별하는 방법, 그리고 hiPSC의 초기 특성 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.