GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

이 절차의 전반적인 목표는 GFP 리포터 시스템을 통해 OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC를 레트로바이러스 매개로 과발현시켜 인간 iPS 세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 양의 개별 GFP 발현 레트로바이러스를 첨가함으로써 수행됩니다. 그다음, GFP 발현 바이러스에 감염된 세포를 마우스 배아 섬유아세포가 포함된 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트로 옮깁니다.

절차의 세 번째 단계는 배지를 인간 배아줄기세포 배양 배지로 교체하는 것입니다. 마지막으로, 인간 배아줄기세포와 유사한 형태를 보이는 GFP 억제 IPS 콜로니를 분리합니다. 최종적으로, 면역형광 염색과 R-T-Q-P-C-R을 통해 내인성 다능성 마커의 발현을 확인합니다.

다능성 표면 마커를 이용한 라이프스타일 염색 및 형태학적 변화 관찰과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 바람직한 iPad입니다. 다능성 세포의 마커로 GFP 발현 소실을 이용하여 세포 콜로니를 쉽게 분리함으로써 배양을 시작할 수 있습니다. 감염 하루 전, 섬유아세포 배지에 인간 섬유아세포를 1 × 10⁵ cells/well 농도로 6-well 플레이트의 한 웰에 분주합니다. 다음 날, 배지를 흡입하여 죽은 세포를 제거하고 5 µg/mL의 protamine sulfate가 포함된 신선한 섬유아세포 배지 2 mL를 첨가합니다.

그런 다음 감염다중도(multiplicity of infection) 5에 해당하는 적정량의 각 GFP 발현 바이러스를 조심스럽게 첨가합니다. 감염 1일 후, 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 바이러스 상층액을 제거하고 2 mL PBS로 3회 세척합니다.

그 후 감염 3일 뒤에 섬유아세포 배지 2 mL를 추가합니다. GFP 형광을 확인하고 웰에 섬유아세포 배지 2 mL를 보충합니다. 다음 날, 0.1% Gelatin이 코팅된 10 cm 페트리 접시에 조사된 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 피더 세포를 섬유아세포 배지 내에서 1 × 10⁴/cm² 밀도로 플레이팅합니다.

세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 감염된 인간 섬유아세포를 1mL의 0.05% trypsin EDTA로 37°C에서 5분 동안 처리하여 떼어낸 후, 200 G에서 5분 동안 원심 분리합니다. 세포를 10mL의 섬유아세포 배지에 재현탁하고, 0.1% gelatin이 사전 코팅된 mfs에 세포를 다시 접종합니다. 24시간 후에 처리합니다.

배지를 HESC 배양 배지로 교체하고 매일 배지를 갈아줍니다. 감염 후 20~27일이 지나면 형광 현미경 하에서 ESC 유사 콜로니가 나타나기 시작합니다. HSC와 유사한 형태를 보이는 콜로니에서 GFP 형광이 없는지 확인하십시오.

10 µL 피펫을 사용하여 개별 IPSC 콜로니를 선택하고, HESC 배지가 보충된 젤라틴 및 meth 코팅 12-웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 매일 배지를 교체하고, 1 mL의 DMM F 12로 플레이트를 세척하여 세포를 계대 배양합니다.

그 다음 collagenase 0.5 mL를 첨가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다. DM A MF 12로 세포를 두 번 세척합니다. 이어서 신선한 HESC 배지 2 mL를 첨가합니다.

그 다음 셀 리프터를 사용하여 콜로니를 작은 조각으로 분쇄하고 플레이트에 남아 있는 세포들을 떼어냅니다. 재현탁된 콜로니 조각들을 젤라틴과 MEF가 코팅된 6-well 플레이트의 한 웰로 옮기고 37°C에서 2일 동안 배양합니다.

면역형광법으로 세포를 확인합니다. PBS로 세포를 3회 세척하고, 실온에서 4%paraldehyde로 20분 동안 고정합니다. PBS로 세포를 조심스럽게 3회 세척한 후, PBS에 희석된 0.2%tritton X 100로 30분 동안 투과화합니다.

PBS 내 3% BSA로 2시간 동안 세포를 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다. 다음으로, 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 그 후 PBS로 세포를 3회 세척하고, 2차 항체와 함께 실온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다.

마지막 세척 단계에서 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. DAPI를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 정량적 실시간 분석을 위해 형광 현미경을 사용하여 세포의 이미지를 획득합니다.

RNA 분리 키트를 사용하여 인간 섬유아세포 유래 인간 IPC에서 총 RNA를 PCR로 분리합니다. 역전사 효소를 사용하여 1차 가닥 cDNA를 합성합니다.

그다음, 이를 템플릿으로 사용하여 QPCR을 통해 다능성 유전자를 검출합니다. OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC를 포함하는 레트로바이러스 칵테일이 감염된 인간 섬유아세포(BJ)의 모습입니다. 여기에는 리프로그래밍 5일째부터 관찰된 형태학적 변화가 나타나 있습니다. 10일, 14일, 21일째의 모습이며, 21일 이후부터 세포들이 HESC와 유사한 형태를 보이기 시작하고, iPSCs는 GFP 형광으로 식별됩니다.

ESC 및 IPC와 같은 다능성 줄기세포는 프로바이러스 유전자 발현을 억제하는 분자 기전을 발현합니다. 하지만 본 실험에서 사용된 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 LTR에 의해 리프로그래밍 유전자와 함께 GFP를 발현합니다. 따라서 GFP를 지속적으로 발현하는 세포는 프로바이러스 유전자 사이런싱 없이 외래 유전자를 발현하고 있는 것으로 간주되며, 여기서 보는 바와 같이 다능성 분자 네트워크(Pluripotency Molecular Network)를 획득하여 충실히 리프로그래밍된 iPSC 콜로니에서는 GFP 발현이 나타나지 않습니다.

이 그림은 TRA 180 1, TRA one 60, SSEA four, T four 및 nano 항체를 이용한 Detroit 5 51 섬유아세포 유래 콜로니의 면역조직화학 분석 결과를 보여주며, 성공적으로 역분화된 IPC가 이 모든 마커를 발현함을 확인할 수 있습니다. 또한, 유전자 발현을 분석하기 위해 정량적 R-T-P-C-R을 수행한 결과, T four, SOX two, KLF four M 및 nano의 발현이 모세포인 섬유아세포에 비해 유의하게 증가하였으며, 이는 H nine HSCs의 발현 수준과 일치함을 나타냈습니다.

이 영상을 시청한 후, 바이러스를 감염시키고 형광 현미경을 사용하여 완전히 lip 프로그래밍된 IPA 세포를 식별하고 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.