Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

bio flux 시스템은 제어된 전단 흐름 하에서 살아있는 세포 분석을 수행하기 위한 자동화 기기 및 미세유체 장치입니다. 이 시스템은 웰 플레이트 미세유체 기술을 사용하여 마이크론 규모의 유동 세포 장치를 SBS 표준 웰 플레이트에 통합합니다. BioFlex는 적은 혈액량으로 고효율의 혈소판 부착 및 응집 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 염료로 표지된 전혈을 웰에 첨가한 후 채널을 통해 흐르게 합니다. 제어된 전단 흐름 하에서 고해상도 현미경 데이터가 생성되며, 이를 통해 약물 화합물 및 기타 다양한 변수가 있을 때의 혈소판 부착 및 응집을 정량화합니다. 안녕하세요, 저는 Flexion Biosciences RD 실험실의 Mike Schwartz입니다.

오늘은 혈소판 부착 분석에 미세유체 유동 셀을 사용하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 프로토콜을 다양한 혈관 생물학 분석에 활용하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

플로우 셀 실험을 수행하기 전, BioFlux 플레이트의 미세유체 채널을 관심 있는 단백질로 코팅하여 준비해야 하며, 본 실험에서는 collagen one을 사용합니다. BioFlux 플레이트의 24개 실험 채널은 각각 입구 웰과 출구 웰에 연결되어 있습니다. 입구 웰은 채널에 용액을 공급하는 왼쪽 웰이며, 출구 웰은 오른쪽에 위치합니다. collagen one 스톡 용액을 200 µg/mL 농도로 희석하십시오.

0.02 M 아세트산의 경우, 사용되는 채널당 20 µL가 필요합니다. 본 실험에서는 11개의 채널이 필요하므로, 콜라겐 코팅액 200 µL를 제조하십시오. 코팅되지 않은 하나의 채널은 마이크로 피펫 팁으로 부드럽게 반복 섞어 줍니다.

마이크로 피펫을 사용하여 각 해당 채널의 웰 내부 펀치에 액체를 분주함으로써 20 µL의 코팅액을 첨가합니다. 여기에 표시된 것과 같이 노란색 염료로 관심 있는 미세유체 채널에 주입하며, 혈소판 부착 및 응집의 음성 대조군으로서 콜라겐이 없는 채널을 하나 포함합니다. 모든 해당 채널에 콜라겐 코팅을 완료한 후, 인터페이스를 플레이트에 부착합니다.

BioFlux 1000 인터페이스를 사용하는 경우, 두 래치를 모두 스테이지에 고정할 수 있습니다. BioFlux 200 인터페이스를 사용하는 경우에는 먼저 네 개의 나사를 조이십시오. 그 후 모든 설정이 완료되면 토크 드라이버를 사용하여 완전히 조여 줍니다.

토크 드라이버가 최대치에 도달하면 클릭 소리가 납니다. bio flux 소프트웨어의 수동 모드를 사용하여, 유출구로부터 cm²당 2D의 속도로 관심 채널에 관류를 적용합니다. 현미경의 저배율 대물렌즈를 사용하여 유입 웰을 찾고, 반대편 내부 펀치가 액체로 채워지는 것을 관찰합니다.

먼저 소량의 액체가 몇 분에 걸쳐 내부 펀치를 천천히 채우는 것을 확인해야 하며, 입구 내부 펀치가 가득 차면 소프트웨어에서 정지 버튼을 눌러 모든 채널의 주입을 중단하십시오. 플레이트를 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 이 배양 기간 동안, 1시간의 배양이 끝날 때쯤 전혈 준비를 시작할 수 있습니다.

혈액 준비가 완료되면 인터페이스를 제거하고, 출구 웰에 칼슘 및 마그네슘 이온이 포함된 PBS 1 mL를 추가합니다. 출구 웰에서 2 dyn/cm²의 속도로 관류를 시작하고 10분 동안 관류를 계속합니다. 10분 후 관류를 중단합니다. 인터페이스를 제거한 후, 입구와 출구 웰 모두에서 과잉의 PBS를 제거합니다.

내부 펀치를 채우고 있는 액체를 절대 제거하지 마십시오. 채널을 차단하려면 각 배출구에 1 mL의 블로킹 용액을 추가하십시오. 사용할 웰을 배출구 웰에서 2 dL/cm²로 관류하고 10분 동안 관류를 계속하십시오.

10분 후 관류를 중단하고 인터페이스를 제거하십시오. 이제 채널이 준비되었으며, 플레이트에 콜라겐 코팅이 진행되는 동안 하루 종일 사용할 수 있습니다. 1시간의 배양 기간 동안, 영상 촬영 및 플레이트 주입을 위해 공복 상태인 피험자로부터 신선한 인간 혈액을 준비해야 합니다.

혈액은 항응고제인 시트르산 나트륨(sodium citrate) 튜브에 채혈하여 수집 후 3시간 이내에 사용해야 합니다. 먼저, DMSO에 녹인 4mM 칼슘 M 스톡 용액을 1:1000(v/v) 비율로 혈액에 첨가합니다. 4µM 칼슘 농도를 맞춘 후, 부드럽게 반전 혼합하여 섞어줍니다.

다음으로, calcium am으로 표지된 혈액 1 mL를 1.5 mL 마이크로 튜브 10개에 각각 분주합니다. 원하는 희석 배율로 GP2B3 억제 항체를 각 튜브에 첨가합니다. 항체를 넣지 않은 음성 대조군과 무관한 항체를 넣은 양성 대조군을 반드시 포함하고, 부드럽게 반전시켜 혼합합니다.

플로우 셀 실험을 수행하기 전, 튜브를 상온에서 1시간 동안 배양하며 10분마다 부드럽게 뒤집어 섞어줍니다. 콜라겐을 위한 자동 프로토콜을 바이오 플럭스 제어 모듈에 설정해야 합니다. 하나. 배출구로부터 10분 동안 10 9 cm²의 속도로 혈액이 흐르도록 프로토콜을 설정합니다.

BioFlex 1000 워크스테이션을 사용하여 데이터 획득 매개변수를 설정해야 하며, 여기에는 원하는 스테이지 위치, 파장 및 타임랩스 설정에서의 획득이 포함됩니다. 본 프로토콜의 전형적인 이미지 획득 계획은 10배 대물렌즈를 사용하여 10분 동안 30초마다 채널당 하나의 시야를 캡처하는 것으로 구성됩니다. 추가적인 시야 설정 및 다른 타임랩스 설정 또한 가능합니다.

자동 프로토콜과 데이터 획득 파라미터 설정이 완료되면, BioFlex 플레이트로 돌아가 내부 펀치를 제외한 채널 양측의 액체를 제거합니다. 신속하게 작업하며, 각 조건의 혈액 500 µL를 각 채널의 출력 웰(output well)에 넣습니다. 출력 웰을 사용하여 혈액을 주입하는 이유는 관찰 구역까지의 경로가 가장 짧아, 콜라겐 코팅에 대한 혈액의 반응을 더 즉각적으로 확인할 수 있기 때문입니다.

또한, 항체가 없는 대조군 혈액을 콜라겐이 코팅된 채널과 블로킹만 처리된 채널에 각각 넣습니다. 플레이트를 BioFlex 1000 워크스테이션 현미경 위에 놓고 인터페이스에 고정합니다. 원점으로 정의된 첫 번째 보정 지점을 찾아 스테이지 리스트 보정을 수행합니다.

그런 다음 두 번째 보정 지점을 찾아 표시합니다. 이 보정 값을 적절한 스테이지 목록에 적용하십시오. 이렇게 하면 플레이트 상의 모든 관찰 위치를 자동으로 찾을 수 있습니다.

스테이지를 혈액이 포함된 채널 중 하나로 이동시킨 후, BioFlex montage 소프트웨어에서 노출 시간 및 게인과 같은 이미지 캡처 파라미터를 설정하십시오. 원하는 버튼을 클릭하여 적절한 워크플로우를 실행하십시오. 그러면 유체 프로토콜과 이미지 획득이 동시에 시작됩니다.

실험이 끝나면 BIOFLU 1000 워크스테이션에서 플레이트를 제거하고 기관 지침에 따라 폐기하십시오. BioFlux 시스템의 콜라겐 코팅 미세유체 채널을 사용합니다. 처리되지 않은 대조군 혈액 샘플에서는 시간이 지남에 따라 급격한 혈전 형성이 관찰됩니다.

반면, 코팅되지 않은 채널에서는 혈전 형성이 관찰되지 않습니다. 최근에 수행된 한 실험에서 대조군 조건하의 응집체 평균 크기는 2000 µm²였습니다. GP IIb/IIIa는 콜라겐 부착에 의해 활성화될 때 혈소판 간의 상호작용과 응집 안정화를 유도하는 강력한 매개체입니다. 여기서 보는 바와 같이, 전단 응력 노출 1시간 전에 anti-GP IIb/IIIa 항체로 배양한 후에는 혈전의 크기 감소뿐만 아니라 혈전 형성 빈도의 감소가 관찰됩니다.

일반적으로 10 dyne cm⁻²에서 용량 의존적 반응을 관찰할 수 있으며, 이 특정 억제제의 IC₅₀ 값은 17 nM이었습니다. 항체 미처리 대조군과 비교하여 이 공여자의 최대 억제율은 10 dyne cm⁻²에서 11%였습니다. 전혈 실험을 위해 최대 200 dyne cm⁻² 또는 5,000 s⁻¹까지 가능한 48-웰 고전단 플레이트도 사용할 수 있습니다.

지금까지 미세유체 흐름 채널을 사용하여 생리학적으로 유의미한 혈관 생물학 실험을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 본 프로토콜을 수행할 때 콜라겐을 적절한 완충액에 희석하는 것이 중요합니다. 공기 방울이 유입되지 않도록 항상 정확한 피펫팅 기술을 사용하고, 실험실의 생물 안전 규정을 항상 준수하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.