라이트 현미경과 연구 Presynaptically 사일런트 시냅스

중추 신경계의 일부 시냅스 전 말단은 기능이 없거나 침묵 상태인 것으로 보입니다. 본 연구에서는 침묵 상태의 시냅스 전 말단을 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 말단을 침묵시키거나 깨우는 것으로 의심되는 처리 및 조작을 식별하는 데 적용될 수 있습니다.

이 프로토콜은 뉴런 탈분극 과정 중 시냅스 소포의 생체 염색과, 이후 고정된 세포를 대상으로 활성 및 비활성 상태의 모든 시냅스 전 말단을 염색하는 항체 라벨링을 결합한 방법입니다. 염료와 항체가 모두 라벨링된 시냅스는 활성 상태입니다. 항체로만 라벨링된 시냅스는 비활성(silent) 상태입니다.

안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 의과대학 정신의학과의 Steve Minick 박사 연구실 소속 Amanda Taylor입니다. 저는 Manic Lab의 Shahin입니다. 오늘은 배양된 해마 뉴런을 이용하여 침묵성 시냅스 전 단자를 시각화하는 절차를 보여드리고자 합니다.

저희 실험실에서는 전기적 활성과 기타 단일 신호 경로가 신경전달물질 방출을 어떻게 조절하는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 멸균 라미나 플로우 후드 내에서, 생후 0~3일 된 쥐(rats 또는 mice)로부터 HIPA can't buy를 사용하여 해리된 세포 배양물을 준비하십시오.

발표된 프로토콜에 따라, 동일한 해부 세포에서 유래한 혼합 글리아 배양물을 멸균된 35 millimeter 디쉬에 분주합니다. 각 디쉬에는 5 mg/mL의 콜라겐으로 코팅된 0번 커버슬립이 포함되어 있습니다. 뉴런을 약 500 cells/cm²의 밀도로 분주합니다.

일반적으로 12마리의 쥐 새끼로 30~35mm 디쉬를 만들 수 있습니다. 배양물을 배양 인큐베이터에서 10~14일 동안 성장시키십시오. 시냅스 발달과 성숙을 위해, in vitro 4일 차에 글리아 세포의 성장을 억제하는 항분열제인 ara-C를 첨가하십시오.

또한 배양 5일 차에, 이 성숙 기간 동안 신경세포의 생존율을 높이기 위해 B 27 보충제가 첨가된 neuro basal medium으로 배지의 절반을 교체합니다. 시냅스 전 무동작 시냅스(presynaptically silent synapses)의 수를 변화시키는 처리를 도입합니다. 글루타메이트 시냅스의 상당 부분을 무동작 상태로 만드는 편리한 방법의 하나로 30 millimolar potassium을 이용한 4시간 처리가 유용함을 확인하였습니다.

배양이 성숙되면 뉴런은 서로 잘 분리된 광범위한 신경 돌기를 가지며 상대적으로 낮은 밀도를 나타내어야 합니다. 배양물을 인큐베이터에서 꺼내 벤치로 옮깁니다. 배양액을 45 millimolar potassium chloride와 10 micromolar FM 1 43 FX dye가 포함된 완충 식염수로 교체합니다.

이 용액에는 재귀적 신호 전달을 방지하기 위해 NBQX와 APV가 포함되어야 합니다. 광퇴색을 방지하기 위해 FM 1 43 FX 스톡 용액과 실험 과정은 암실 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 이후의 모든 배양 단계에서 배양 접시를 알루미늄 호일로 덮어주십시오.

실온에서 정확히 2분 동안 배양하십시오. 염색액을 제거하고, 비특이적 염색을 제거하기 위해 500 $\mu$M AZIDE가 포함된 HEPES buffered saline으로 3~5초 동안만 세척하십시오. 이 단계에서의 시간 조절이 매우 중요합니다.

adverse F seven에 장기간 노출되면 모든 FM 43 FX 표지가 제거됩니다. 그런 다음 화학 흄 후드 내에서 adverse seven이 포함되지 않은 인산완충식염수로 세포를 2분 간격으로 5회 세척하십시오.

PBS에 4% paraformaldehyde와 0.2% glutaraldehyde를 혼합한 용액으로 10분 동안 배양물을 고정합니다. PBS로 세포를 짧게 세척합니다. 이제 세포를 흄후드 밖으로 옮길 수 있습니다.

배경 신호를 줄이고 면역 염색을 위해 세포를 투과시키고자 4% normal goat serum과 0.04% tritton X가 포함된 블로킹 용액을 첨가합니다. 15분 동안 배양합니다. 블로킹 용액으로 1:2000으로 희석한 vlu T one 항체로 세포를 염색합니다.

항체가 포함된 배양액에서 부드럽게 흔들어주며 3시간 동안 배양합니다. PBS로 세포를 4회 세척합니다. Alexa와 함께 세포를 배양합니다.

블로킹 용액에 1:500으로 희석한 6 47 접합 항 Guinea pig 항체를 준비합니다. 2차 항체가 들어있는 배양물을 가볍게 흔들어주며 30분 동안 유지합니다. PBS로 세포를 4회 더 세척합니다.

포셉을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드 위에 소량의 도말액을 한 방울 떨어뜨립니다. 커버 슬립을 집어 도말액 방울 위에 세포가 슬라이드를 향하도록 조심스럽게 덮습니다. 슬라이드를 하룻밤 동안 건조시킵니다.

공초점 레이저 주사 현미경에 60x 오일 렌즈를 준비합니다. 커버 슬립이 대물렌즈를 향하도록 슬라이드를 스테이지 위에 놓습니다. 잔류 염료가 남아 있을 수 있는 세포체(soma)에서 떨어져 있으며, 밀도가 너무 높지 않은 신경돌기(neurite) 영역을 찾습니다.

시야 크기를 51 by 51 microns로 확대합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여, 단계당 0.3 microns씩 27단계로 총 7.8 microns의 깊이를 커버하는 ZS 스택을 획득합니다.

먼저 VLU T one 항체를 스캔하여 시야 내의 모든 글루타메이트성 시냅스를 식별합니다. 그다음 FM 1 43 FX 형광을 재스캔하여 획득 후 이미지를 분석합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 각 픽셀의 임계값을 설정한 후, 모든 평면에서의 최대 강도 읽기 값을 기반으로 Z 스택을 합성 단일 평면 이미지로 변환합니다.

배경 신호를 줄이기 위해, FM 1 43 염색 효과를 참조하지 않고 VG glu T one 말단을 확인합니다. 그리고 이러한 puncta를 관심 영역으로 표시합니다. 일반적으로 시야당 10개의 PUNTA를 선택합니다.

FM 1 43 효과 이미지에 대해 임계값 설정과 펀크타 선택 과정을 반복하고, 이미지들을 중첩하여 침묵 시냅스(silent synapses)를 식별합니다. 활성 상태의 FM 1 43 양성 시냅스와 비활성 상태의 FM 1 43 음성 시냅스를 구분하기 위해 절대 픽셀 기준 또는 백분율 픽셀 기준을 사용할 수 있습니다. 본 연구의 배양 세포에서는 초록색 FM 1 43 형광과 빨간색 V glut one 염색의 중첩 이미지에서, V glut one 염색으로 정의된 글루타메이트 시냅스의 70~80%가 검출 가능한 FM 1 43 염색을 나타내는 것을 확인하였습니다.

이는 공동 국소화된 마커와 시냅스를 형성하는 수많은 노란색 점으로 분명하게 나타납니다. 이들은 화살표로 표시되어 있습니다. 적색 Vglut1 양성 점의 약 20에서 30%는 기저선 이상의 녹색 FM 1-43 형광을 나타내지 않을 것입니다.

이들은 비활성 시냅스 전 말단이며, 화살표 머리로 표시된 것이 그 예시입니다. 세 번째 시냅스 집단 또한 관찰될 것입니다. 이들은 녹색 FM 1 43 형광에는 양성이지만, 적색 B glut one 염색은 나타나지 않습니다.

이들은 활성 GABA 작동성 시냅스이며, 별표로 표시된 것이 그 예시입니다. 이들은 대부분의 분석에서 제외되지만, 소포성 GABA 운반체 항체를 사용하여 명시적으로 연구할 수 있습니다. VLU T one 항체 대신, FM 1 43 및 VLU one 면역 염색을 사용하여 시냅스 전 침묵 시냅스를 시각화하는 방법을 방금 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때, FM 1 43 FX가 adver sub seven 세척 시간과 블로킹 용액에 포함된 처리 X 100 농도 모두에 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.