Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

안녕하십니까, 막 구조 및 기능 생물학 연구 그룹에 오신 것을 환영합니다. 저는 Martin Caffery입니다. 저희 연구의 중심은 생체막이며, 이에 대한 도식은 첫 번째 슬라이드에 나와 있습니다. 세포와 하부 세포 소기관(존재하는 경우)을 둘러싸고 있는 막은 지질 분자 두 개 정도의 두께를 가진 분자 수준의 얇은 구조이며, 그 속에 단백질들이 박혀 있습니다.

우리는 지질과 단백질 모두에 적용되는 구조와 기능에 관심을 가지고 있습니다. 하지만 이번 JO 시리즈의 목적을 위해, 저는 막 단백질에 초점을 맞추어 설명하겠습니다. 우리가 이 막 단백질들이 분자 수준에서 어떻게 기능하는지 이해하고자 하는 이유는 두 가지입니다.

첫째로, 무언가가 어떻게 작동하는지 아는 것에서 오는 지적 만족감이 있습니다. 둘째로, 자전거나 자동차와 마찬가지로 작동 원리를 알면 오작동 시 이를 수정할 수 있는 가능성이 생깁니다. 약물 설계는 이러한 유형의 연구를 통해 얻을 수 있는 분명한 결과물입니다.

막 단백질이 분자 수준에서 어떻게 작동하는지 파악하기 위해 우리가 취하는 접근 방식은 결정학적 구조를 결정하는 것입니다. 여기에는 단백질을 구성하는 모든 원자, 또는 적어도 모든 비수소 원자의 3차원 공간상 위치를 설정하는 과정이 포함됩니다. 이 목적을 위해 우리가 사용하는 방법은 거대분자 X선 결정학(줄여서 MX)이라고 합니다.

여기서는 MX를 사용하여 구조가 결정된 막 단백질의 예를 볼 수 있으며, MX를 수행하기 위해서는 단백질의 분획 품질 결정이 필요합니다. 그림에서 보시는 바와 같이, 거대 분자 결정학을 이용한 구조 결정에는 많은 단계가 수반됩니다. 일반적으로 여기에는 막 단백질 표적을 식별한 후, 이를 생산, 정제 및 결정화하는 과정이 포함됩니다.

자체 x-ray 소스 또는 방사광 가속기 x-ray 소스를 사용하여 결정의 회절 측정을 수행합니다. 회절 데이터를 처리하여 전자 밀도 지도를 생성하고, 이를 분자 모델에 맞춥니다. 정밀하게 다듬어진 모델은 단백질의 작용 기전을 탐구하고 구조 기반 약물 설계를 하는 데 사용될 수 있습니다.

이 JoVE 논문의 목적은 소위 인메조(in meso) 방법이라 불리는 지질 메조상(lipid meso phases)을 이용하여 어떻게 막단백질의 고품질 결정을 생성하는지 보여주는 것입니다. 이 방법과 그 범위에 관한 최신 리뷰 논문은 참고문헌 1에서 확인할 수 있습니다. 여기서 우리가 수행할 단계별 프로토콜은 참고문헌 2에 기술되어 있으며, 인메조 막단백질 결정화 실험 설정에 소요되는 단계와 시간을 요약한 흐름도가 여기에 제시되어 있습니다.

이 영상에서는 빨간색 점선으로 표시된 단계들을 다룹니다. 수동 모드에서 중간상 결정화를 수행하는 데 필요한 항목들이 여기에 표시되어 있습니다. 여기에는 호스트 중간상을 생성하기 위한 정제된 막 단백질 지질의 농축 용액이 포함되며, 일반적으로 지질을 더 명확하게 관찰하기 위해 mono ole을 사용합니다.

본 영상에서는 적색 염료 침전 용액, 정제수 파이펫팅 장치 및 일회용 팁, 그리고 일부는 바늘 분리가 가능한 다양한 크기의 가스 밀폐형 Hamilton 시린지가 사용되었습니다. 또한, 단백질 용액과 지질을 혼합하여 미셀을 생성하는 데 사용되는 좁은 구경의 커플러, Hamilton 사의 반복 분주기, 유리 현미경 슬라이드 및 커버 슬립이 사용되었습니다. 웰 생성을 위해 이상적으로 실란화 처리된 타공 양면 스페이서 테이프, 핀셋, crushed ice, 티슈, 계산기, 그리고 무엇보다 가장 중요한 실험 노트가 필요합니다.

다음 절차는 유리 샌드위치 결정화 플레이트를 준비하는 데 사용됩니다. 로딩을 위해 실란화된 현미경 슬라이드를 벤치 위에 놓으십시오. 타공된 양면 스페이서 테이프 조각의 한쪽 표면에서 보호 종이 커버를 제거하십시오.

테이프의 접착면이 슬라이드 표면에 닿도록 배치하고 압력을 가합니다. 테이프를 슬라이드에 밀봉합니다. 브레이어(brayer) 또는 롤러를 사용하며, 웰의 바닥을 보호하기 위해 테이프와 롤러 사이에 알루미늄 호일을 배치할 수 있습니다.

테이프에서 두 번째 종이 커버를 제거하여 상단의 점착면이 드러나게 합니다. 이 과정을 통해 로딩 준비가 완료된 유리 플레이트가 생성되며, 로딩이 끝나는 즉시 밀봉할 수 있습니다. 웰을 빠르고 효율적으로 밀봉할 수 있도록 개별 실로라이즈드 커버 슬립을 플레이트 가까이에 배치하십시오.

지질을 45 °C로 설정된 온도 조절 블록에 3분 동안 두어 액체 상태로 만듭니다. 사용되는 지질은 일반적으로 mono land입니다. 본 영상에서는 지질이 녹는 과정을 시각적으로 보여주기 위해 빨간색 염료를 첨가하였습니다.

지질 단백질 혼합 단계에서 사용할 100 µL 가스 타이트 Hamilton 시린지 두 개를 준비합니다. 단백질 용액을 담을 시린지에서 테플론 오일을 제거합니다. 그 옆에 지질을 담을 시린지를 놓습니다. 이 경우, 오일은 그대로 둡니다.

두 주사기 사이에 좁은 보어 커플러를 배치한 다음, 커플러를 지질 주사기 핑거에 연결합니다. 커플러를 주사기에 단단히 조이되, 과하게 조이지 않도록 주의합니다. 지질 주사기의 배럴에서 플런저를 제거합니다.

지질이 녹아 있는 상태인지 확인하십시오. 피펫을 30 µL로 설정하고 녹은 지질 30 µL를 천천히 흡입하십시오. 지질 바이알의 캡을 닫으십시오.

지질은 질소 또는 아르곤 기체 하에 -80 °C에서 보관해야 합니다. 녹은 지질을 가능한 많이 시린지의 열린 끝부분으로 천천히 주입합니다. 이때 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오.

플런저를 용융된 지질과 접촉하도록 배럴 안에 넣고, 시린지를 수직으로 세운 상태에서 플런저를 배럴 위쪽으로 천천히 밀어 올립니다. 그림과 같이, 실수로 갇힌 공기 방울이 이 과정에서 위로 올라와 배출됩니다. 이제 배럴 안에 용융된 지질 플러그가 형성되었으며, 이 부피를 정확하게 측정해야 합니다.

이는 시린지 배럴의 표시를 읽어 확인할 수 있습니다. 이 경우 부피는 23 µL이며, 이를 실험 노트에 기록합니다. 커플러에서 뻗어 나온 바늘 위로 퍼(fur)를 밀어 넣습니다.

플런저를 사용하여 용융된 지질을 배럴 위로 밀어 올려 커플러 중심에 있는 바늘 속으로 천천히 그리고 조심스럽게 주입합니다. 바늘에 지질이 약간 과하게 채워지면, 개방된 끝부분으로 지질이 밀려 나오는 것을 확인할 수 있습니다. 플런저를 살짝 뒤로 당겨 과잉 지질을 커플러 내부로 다시 회수하여, 지질이 커플러 바늘 끝과 딱 맞게 일치하도록 조절합니다.

이 경우, 시린지 커플러 유닛이 완전히 장착되어 단백질 시린지와 결합할 준비가 된 상태입니다. 큰 응집체를 제거하기 위해 용액을 14,000 G에서 10분 동안, 4 °C에서 5~10분 동안 원심분리해야 합니다. 결정화 실험을 설정하기 전에 얼음 버킷에서 단백질 용액을 꺼내 실온에서 평형화하십시오.

20 °C에서 완전 수화 상태 또는 그에 가까운 입방상을 형성하기 위해 사용할 단백질 용액의 부피를 계산하십시오. 상평형도에서와 같이 물을 이용한 완전 수화는 중량 대비 약 40%의 물에서 발생합니다. 지질 시린지에 0.94 mg/µL 밀도의 mono를 23 µL 장입했음을 기억하십시오.

이는 지질 21.6 mg에 해당하므로, 21.6에 4를 곱한 후 6으로 나눈 값인 14.4 mg 또는 단백질 용액 14.4 µL가 필요합니다. 25 µL 또는 50 µL Hamilton 시린지를 사용하여 필요한 양의 단백질 용액을 취한 다음, 해당 용액을 시린지 배럴 내 플런저의 테플론 팁 위로 옮깁니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 조심스럽게 바늘을 뽑고 시린지 내 단백질 용액의 부피를 측정합니다. 이 값은 이전 단계에서 전달된 값과 일치해야 합니다.

지질이 충전된 주사기와 결합하기 위한 준비 단계입니다. 단백질 용액을 배럴 끝부분과 수평이 될 때까지 조심스럽게 밀어 올립니다. 이는 배럴의 끝단 쪽에서 내부를 내려다보며 확인할 수 있습니다.

리핀 단백질 용액과 충전된 주사기를 결합할 준비가 되었습니다. 이를 위해 단백질 주사기를 지질 주사기에 연결된 커플러의 열린 끝부분에 돌려서 끼우십시오. 커플러를 통해 두 주사기를 결합하면, 한쪽 주사기의 지질부터 커플러를 거쳐 다른 쪽 주사기의 단백질 용액까지 액체가 연속적인 부피로 연결되어 있어야 합니다.

혼합 준비를 위해, 조립된 장치를 잡고 오른손에 시린지 하나를, 왼손에 다른 하나를 쥐어 고정합니다. 커플러를 통해 양쪽 배럴에 토크를 가하는데, 이때 양손의 손가락과 엄지손가락을 사용하여 조이는 과정에서 커플러의 홈에 대한 밀봉 상태가 그대로 유지되도록 합니다. 이 단계에서 혼합 장치가 잘못 조립되어 ALS가 손상되거나, 과하게 조여 누출이 발생하는 경우 모두 결과적으로 누출로 이어지게 됩니다.

이는 불가피한 시행착오와 간혹 발생하는 시료 손실을 통해 얻어지는 경험의 문제입니다. 따라서 귀중한 단백질 용액을 사용하기 전에 지질과 물 또는 완충액을 사용하여 시스템의 감각을 익히는 연습을 하는 것이 좋습니다. 혼합을 수행하려면, 조립된 혼합 장치의 단백질 측 플런저를 엄지나 검지로 끝까지 밀어 단백질 용액이 단백질 주사기에서 커플러를 통해 지질 주사기로 밀려 나가게 합니다. 장치가 효과적으로 밀봉되었다면, 이 동작으로 인해 지질 측 플런저가 동일한 거리만큼 반대 방향으로 이동하게 됩니다.

이제 지질 쪽의 플런저를 사용하여 지질 시린지의 내용물을 콜러(coler)를 통해 다시 단백질 시린지로 밀어 넣습니다. 이 과정을 여러 번 반복합니다. 균질한 혼합상을 생성하기 위해 때로는 100회 이상의 통과 과정이 필요합니다.

혼합 시작 시, 커플러를 통한 물질의 왕복 이동이 고르지 않을 수 있으며, 때로는 혼합을 위해 추가적인 힘이 필요할 수 있습니다. 이는 예상되는 현상입니다. 초기 혼합 시에는 일반적으로 시료에 불균일한 혼탁 현상이 동반되며, 이 또한 예상되는 결과입니다.

균질화가 진행됨에 따라, 플런저를 앞뒤로 움직이는 데 필요한 힘으로 느껴지는 질감이 더 균일해지고 점성 큐빅 상(cubic phase)의 특성을 띠게 되며, 나타나는 큐빅 상의 시각적 외관 또한 마찬가지로 변화합니다. 조건이 적절하여 큐빅 상이 형성되면, 시린지 배럴 내의 분산액은 광학적으로 투명하게 보여야 합니다.

따라서, 시린지 배럴에 표시된 눈금이 배럴 내의 메조상(meso phase)을 통해 명확하게 보여야 합니다. 유색 단백질의 경우, 메조상은 단백질의 색을 띠게 되지만 광학적으로는 투명합니다. 시린지 믹서를 짧은 시간 동안 얼음에 놓아 혼합 과정 중 샘플을 아주 약간 냉각시키면, 균질화와 투명도 확보를 가속화할 수 있습니다.

하지만 샘플을 과도하게 섞지 않는 것이 중요하며, 마찰열로 인해 샘플 온도가 상승할 수 있으므로 매우 격렬한 혼합은 피하도록 주의해야 합니다. 이 시점에서 큐빅 메조페이즈(cubic mesophase)가 형성되었으며 단백질이 지질 이중층으로 재구성됩니다. 이제 메조페이즈를 결정화 플레이트의 개별 웰에 분주할 준비가 되었습니다.

먼저, 중간상을 리피팅 디스펜서에 장착된 10 µL Hamilton 시린지로 옮겨야 합니다. 시린지를 디스펜서에 연결하여 이 과정을 시작하십시오. 큐빅 중간상을 시린지에 충전합니다.

주사기에서 바늘과 플런저를 제거합니다. 테플론 밸브는 그대로 둡니다. 작은 동전을 사용하여 디스펜서에서 고정 너트를 제거합니다.

래칫 암(ratchet arm)을 완전히 뒤로 뺀 상태에서, 플런저와 바늘을 제거한 주사기를 디스펜서의 홀딩 링에 삽입합니다. 고정 너트를 가스켓 면이 주사기를 향하게 하여 배치한 후, 주사기의 열린 끝부분에 단단히 조여 고정합니다.

주사기가 홀딩 링의 중앙에 적절히 위치하고 배럴이 래칫 암과 평행하게 정렬되었는지 확인해야 합니다. 이 두 가지 사항은 매우 중요한데, 플런저가 자유롭게 움직이지 않으면 로딩 중에 소스 주사기 내에 압력이 쌓여 누출이 발생할 수 있기 때문입니다. 그리퍼 너트를 몇 바퀴 푼 상태에서 플런저를 그리핑 링에 통과시킨 후, 플런저를 주사기의 열린 끝부분으로 안내하여 삽입하십시오.

래칫 암을 완전히 눌러 플런저를 배럴 내부로 이동시키고, 플런저가 배럴 안에서 걸림 없이 끝까지 이동하는지 확인합니다. 나사와 가이드 바가 느슨해졌다면 다시 조인 후 플런저가 자유롭게 이동하는지 재확인하십시오. 이제 분주용 시린지를 로딩할 준비가 되었습니다.

조립된 혼합 장치 한쪽에 있는 플런저를 0 µL 눈금 표시까지 이동시킵니다. 메조상(meso phase)을 다른 시린지와 커플러로 옮기기 위해, UL이 장착된 빈 시린지를 혼합 장치에서 분리하고, 즉시 커플러가 부착된 충전 시린지를 10 µL 분주 시린지의 나사산 끝부분에 연결하십시오.

커플링의 체결 강도는 매우 중요합니다. 앞서 언급한 바와 같이, 100 µL 시린지의 플런저를 눌러 메조상(meso phase)이 커플러를 통해 전달되도록 하여 디스펜싱 시린지를 충전합니다. 커플링이 단단히 체결되어 있고 디스펜싱 시린지의 플런저가 자유롭게 움직인다면, 디스펜싱 시린지가 채워짐에 따라 플런저가 로딩 플런저의 이동 방향으로 움직이기 시작해야 합니다.

커플러가 장착된 로딩 시린지를 디스펜싱 시린지에서 분리하십시오. 짧고 끝이 평평한 바늘을 디스펜싱 시린지의 스틸 터미네이션에 고정하고 조심스럽게 조여 고정합니다. 그리핑 링의 매듭을 조여 플런저를 래칫 암에 고정하십시오.

매듭을 너무 세게 조이지 않도록 주의해야 합니다. 과하게 조일 경우 플런저에 흠집이 생기거나 변형되어 사용할 수 없게 될 수 있기 때문입니다. 클램핑 상태에서 래칫 암에 제공되는 이동 범위가 1인치를 넘지 않도록 제한하는 것이 중요합니다.

이후의 과정에서 볼 수 있듯이, 플런저가 휘어지는 경향이 있어 약물 전달에 실패할 수 있습니다. 래칫 드럼을 여러 번 눌러 배럴 안의 플런저를 전진시켜 바늘의 빈 공간을 채우고 바늘에 약물을 로딩합니다. 바늘 끝에서 메사 상(mesa phase)이 연속적인 줄 형태로 나올 때까지 이 단계를 최대 10회 반복해야 합니다.

이제 바늘을 사용하여 결정화 시험 설정을 시작할 수 있으며, 이는 즉시 수행되어야 합니다. 결정화 시험을 설정하기 전까지 단백질이 로딩된 큐빅 페이즈(cubic phase)를 너무 오래 유지하는 것은 권장되지 않습니다. 일부 단백질은 침전제가 첨가되지 않은 큐빅 페이즈에서 불안정하므로, 로딩을 쉽게 하기 위해 벤치 위로 몇 인치 높인 표면에 멀티웰 결정화 플레이트와 커버 슬립을 배치하십시오.

표면이 약간 어두울 때 최적의 대조도와 향상된 가시성이 확보됩니다. 침전제 용액을 균질화하고 바이알의 캡을 엽니다. 디스펜싱 시린지를 한 손으로 수직으로 잡은 상태에서 침전제 분주 프로브를 1 µL로 설정하고, 다른 한 손을 사용하여 바늘 끝을 웰 바닥의 중앙 바로 위에 위치시킵니다.

첫 번째 단계입니다. 반복 분주기의 버튼을 눌러 유리 표면에 200 nanoliters 부피의 시료 덩어리를 분주합니다.

표준 반복 분주기를 10 µL 시린지와 함께 사용할 때, 바늘 끝은 웰 바닥에서 수백 µm 이내에 위치해야 합니다. 적절한 분주를 보장함으로써 재현성 있는 분주를 쉽게 달성할 수 있으며, 이는 약간의 연습만으로 가능합니다. 인접한 4개의 웰에 mease를 로딩한 후, 각 mease 볼루스 위에 침전제 용액 1 µL를 떨어뜨립니다.

특허당 2 µL의 용량과 표준 일회용 팁을 사용하여 최대한 빠르게 분주한 후, 채워진 웰 위에 커버슬립을 정사각형으로 정확하게 배치하여 균일하게 덮음으로써 수밀 봉인을 형성합니다. 스패튤라를 사용하여 스페이서 테이프의 노출된 접착 표면과 접촉하는 커버슬립 부위에 압력을 가합니다. 모든 웰에 시료가 로드되고 밀봉될 때까지 측정물 및 침전제 분주 과정을 반복할 수 있습니다.

이제 플레이트를 검사하고 배양할 준비가 되었습니다. 추적을 위해 플레이트에 라벨을 명확하게 부착하십시오. 빛에 민감한 단백질의 경우, 일반적으로 플레이트를 알루미늄 호일로 감싼 후 배양 챔버에 넣습니다.

이들은 제거하여 은은한 조명이나 적절한 색상의 조명 아래에서 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 보통 20 °C 정도의 온도가 조절되는 챔버에 플레이트를 배치하십시오. 정해진 일정에 따라, 10배 또는 20배 배율의 편광 현미경을 사용하여 벽면의 결정 성장을 검사하십시오.

목적, 저자의 실험실에서 사용된 일정은 다음과 같습니다: 세팅 후 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30일. 미세 볼루스를 세심하게 검사하십시오. 140 micron 두께의 샘플 내에서 초점 깊이를 조정합니다.

검사는 일반광과 직교 편광판 사이 모두에서 수행해야 하며, 입방상(cubic phase)에서 성장한 무색 막 단백질 결정은 일반광으로 보았을 때 이와 같은 모습입니다. 편광으로 보았을 때 meso 상에서 성장한 무색 막 단백질 결정은 이와 같거나 저와 같은 모습이며, 일반광으로 보았을 때 meso 상에서 성장한 천연 색상의 막 단백질은 이와 같거나 저와 같은 모습입니다.

구조 결정의 전체 과정에서 다음 단계는 결정을 수확하여 급속 냉각(cryo cool)하고, 결정으로부터 X선 회절 데이터를 기록 및 처리하는 것입니다. 이러한 주제들은 본 시리즈의 다른 JoVE 논문에서 다룹니다.