Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

본 영상에서는 Lipic B cell을 사용하여 정제된 막 단백질의 고처리량 결정화 실험을 설정하는 방법을 시연합니다. 먼저, 지질과 계면활성제를 혼합하여 B cell을 준비하고, 정제된 막 단백질을 B cell 혼합물에 통합시킨 후 나노리터 로봇을 이용하여 결정화 실험을 수행합니다. 표준 광학 현미경을 사용한 시각적 검사를 통해 결정의 존재 여부를 확인합니다.

단백질 결정이 형성되면, 데이터 수집 및 구조 결정을 위해 이를 추출하여 급속 동결할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 B cell의 독특한 상 거동 덕분에 실험실에서 사용 가능한 표준 장비와 로보틱스를 결정화에 활용할 수 있다는 점입니다. B cell 설정은 매우 간단한 기술이며, 표적으로 하는 막 단백질을 세제 미셀에서 분리하여 지질 매질로 옮길 수 있게 해줍니다.

이를 통해 스크리닝할 수 있는 완전히 새로운 조건 세트를 확보할 수 있습니다. 이 방법은 매우 간단하며 이미 많은 막단백질에 성공적으로 적용되었으므로, 시도하지 않을 이유가 없습니다. B-cell 기반 결정화의 첫 번째 단계는 B-cell을 형성하는 지질 양친매성 혼합물을 준비하는 것입니다.

이 과정은 상당한 노력이 필요하며 가장 많은 시간이 소요됩니다. 완료까지 수 시간이 걸릴 수 있음을 유의하십시오. B cell은 다양한 지질 양친매성(lipid amphi) 조합과 넓은 농도 범위에서 형성될 수 있습니다.

권장 시작 조건은 함께 제공되는 서면 프로토콜의 표 1을 참조하십시오. 먼저 2.8:1 몰 비율의 35% DMPC/Chapro 혼합물 1 mL를 준비합니다. 이를 위해 튜브에 DMPC 0.26 g과 Chapro 0.09 g을 정량합니다. 탈이온수를 사용하여 부피를 1.0 mL로 맞춘 후 혼합물을 볼텍싱합니다.

다음으로, 혼합물을 항온수조에서 약 40 °C로 가온하여 겔 상태가 될 때까지 기다립니다. 이후 튜브를 얼음에 놓습니다. 그러면 샘플이 다시 액체 상태가 됩니다.

그런 다음 다시 몇 분 동안 볼텍싱하고, 지질이 완전히 용해될 때까지 가온, 냉각 및 볼텍싱 단계를 계속 반복합니다. 사이클 횟수가 늘어남에 따라 냉각 후 혼합물이 탁해질 수 있음에 유의하십시오. 혼합물은 실온 또는 그 이상의 온도에서 투명한 겔 상태가 되며, 얼음 위에서는 점성이 있는 액체 상태가 됩니다. 세포는 장기 보관을 위해 -20 °C에 보관할 수 있습니다.

다음으로 정제된 단백질을 B 세포 배지에 혼합합니다. 이는 간단한 과정이며, 비디오의 다음 섹션에서 보여줄 결정화와 같은 날에 수행해야 합니다. DMPC capso B 세포 혼합물을 상온에서 해동하여 상이 투명한 겔 상태로 변할 때까지 기다립니다.

혼합물을 얼음 위에 놓아 액체 상태로 만든 다음, 짧게 볼텍싱하여 균질한 B 세포 상을 다시 형성합니다. 이 시점부터 B 세포 혼합물과 정제된 단백질은 얼음 위에 보관하십시오. 이렇게 하면 B 세포가 액체 상으로 유지되어 피펫팅이 가능해집니다.

다음으로, B 세포 혼합물을 정제된 세제 가용화 단백질에 1:4 부피 비율로 첨가합니다. 그런 다음 용액이 투명하고 균질해질 때까지 파이펫으로 부드럽게 섞어줍니다. 기포가 발생하면 탁상 원심분리기를 사용하여 짧게 원심분리하여 제거합니다.

단백질이 세포 내로 완전히 통합되도록 혼합물을 얼음 위에서 최소 30분 동안 배양합니다. 이제 단백질-세포 혼합물을 결정화 실험에 사용할 수 있습니다. 결정화 실험은 mosquito 결정화 로봇을 사용하여 시연합니다.

96-well V-bottom 플레이트를 얼음 위에 놓아 냉각합니다. 용액의 점도를 최소화하기 위해 단백질 및 세포 혼합액을 플레이트에 피펫팅합니다. 최종 단계까지 단백질 및 세포 혼합액을 얼음 위에 보관하십시오.

여기에 사용된 로봇에는 5개의 플랫폼이 있습니다. 리저버가 포함된 마이크로플레이트를 플랫폼 3에 놓고, 드롭이 분주될 결정화 덮개를 플랫폼 5에 놓으십시오. 그런 다음 분주 위치와 가장 가까운 플랫폼 4에 세포 기반 단백질 플레이트를 놓으십시오.

이를 통해 단백질-세포 혼합물이 로봇에 의해 마지막으로 흡입되고 즉시 분주되도록 합니다. 소프트웨어를 사용하여 실행을 시작하면, 로봇이 리저버 용액을 먼저 흡입한 다음 단백질-세포 혼합물을 흡입하여 뚜껑 위에 방울 형태로 분주함으로써, 분주 과정 중의 가열 및 점도 증가를 방지합니다. 실행이 완료된 직후에 mosquito가 리저버 용액과 단백질-세포 혼합물을 혼합하도록 프로그래밍하지 마십시오.

기기에서 buy cell 단백질 플레이트를 꺼내 얼음 위에 둡니다. 기기에서 덮개를 제거하여 리저버 솔루션이 담긴 플레이트 위에 방울들이 뒤집히도록 놓습니다. 플레이트를 20 °C에서 배양합니다.

결정 형성 및 최적화를 위해 다른 온도 또한 테스트할 수 있음을 유의하십시오. 더 높은 온도는 라멜라 상(lamellar phase)을 유도하며, 이는 단백질을 층상으로 사전 조직화한다는 장점이 있습니다. 4 °C에서 20 °C 사이의 온도를 스크리닝할 수 있습니다.

4°C 미만의 온도는 장기간에 걸쳐 지질을 침전시킬 수 있으므로, 첫째 날, 셋째 날, 그리고 그 이후로는 매주 표준 광학 현미경을 사용하여 결정의 외형과 성장을 평가하십시오. 여기에는 assault only 조건에서 관찰된 바늘 모양 결정의 명시야 이미지와 UV 이미지가 제시되어 있습니다. 결정에서 형광이 검출되지 않았으며, 이는 이 이미지에서 위양성이 나타났음을 나타냅니다.

침전제로 methyl propane diol을 사용했을 때 형성된 막대 모양의 결정입니다. 결정이 약하게 형광을 띠어 단백질 결정일 가능성이 있었으나, X선 회절 분석 결과 단백질 결정이 아닌 것으로 확인되었습니다. 여기 제시된 것은 실험 설정 약 4주 후에 관찰된 결정입니다.

UV 광선 아래에서 강한 형광이 나타나는 것은 이것이 단백질 결정임을 확인시켜 줍니다. 이 비디오에서 보신 바와 같습니다. B 세포가 준비되면 정제된 단백질과 직접 혼합할 수 있으며, 이 시점부터 결정화 과정은 표준 계면활성제 기반 프로토콜과 거의 동일하게 진행됩니다.

또 다른 뚜렷한 장점은 최적화를 목적으로 B 세포에 특정 지질을 도핑할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 활용도가 매우 높고 사용법이 매우 간단하므로, 모든 막단백질 결정화 프로젝트에 시도해 보아야 합니다.