전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

본 절차의 전반적인 목표는 전자 결정학을 통한 막 단백질의 구조 결정을 위해 가장 최적의 2D 결정화 조건을 확인하는 것입니다. 이는 먼저 정제 과정 중 적절한 계면활성제를 사용하여 천연 지질 이중층으로부터 단백질을 가용화함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 외인성 지질을 첨가하고 단백질-지질-계면활성제 혼합물을 투석하여 계면활성제를 제거하는 것이며, 이를 통해 세밀하게 제어된 조건 하에서 2D 결정을 형성하게 됩니다.

절차의 세 번째 단계는 샘플을 급속 냉동하여 유리 상태로 만드는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 cryo EM으로 데이터를 수집하는 것입니다. 최종적으로, 수집된 데이터의 계산적 이미지 처리를 통해 단백질의 최종 구조를 도출하는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 조지아 공과대학교 생물공학 대학 연구실의 Tina Dreaded입니다.

저는 조지아 공과대학교 화학 및 생화학 대학의 Berry Lab과 생물학 대학의 Schmidt Kray Lab 소속입니다. 그리고 저는 조지아 공과대학교 생물학 대학의 Ingleborg Schmidt Cry 연구실 소속 Matt Johnson입니다. 오늘은 EM을 통해 2D choral ation trial을 평가하는 절차를 보여드리겠습니다.

본 연구실에서는 2D 결정화 조건을 확인하고 최적화하기 위해 이 프로토콜을 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 탄소가 코팅된 400 mesh 구리 투과전자현미경(TEM) 그리드 상에 음성 염색된 시료를 준비합니다. 탄소가 코팅된 TEM 그리드 아래에 단백질 리포좀 시료 2 µL를 피펫으로 분주하고 60초 동안 배양합니다.

시료가 고르게 분포되지 않은 경우, 피펫 팁의 측면으로 부드럽게 밀어줍니다. 다음으로, 찢은 Watman 4번 여과지를 사용하여 가장자리 부분을 막아줍니다. 이렇게 하면 protea 리포좀의 과도한 제거 없이 액체를 최적으로 제거할 수 있으며, 섬세한 카본 필름을 보호하는 데 도움이 됩니다.

블로팅 직후에 수행합니다. 30초 후에 1% uranyl acetate 염색액 2 µL를 도포하고, 그리드 가장자리부터 블로팅합니다. 다시 한번 언급하자면, 샘플에 점성이 높은 glycerol 또는 sucrose가 통상 10~20% 범위로 고농도로 포함되어 있는 경우, 음성 염색 전에 glycerol이나 sucrose가 없는 완충액으로 그리드를 여러 차례 세척하는 것이 uranyl acetate 용액으로 적절히 염색하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그리드 준비가 완료되면, 저배율 전자현미경 관찰을 통해 막의 발생 분포와 형태 및 전반적인 그리드 품질을 평가합니다. 그다음 고배율을 사용하여 이미지를 얻고, 이미지의 RIA 변환을 수행하여 2D 결정을 식별합니다. 전자현미경 샘플 홀더에 그리드를 장착한 후, 평균 막 분포에 대한 1차적인 파악을 위해 2000에서 10,000 x의 중간 배율을 사용하십시오.

막의 분포 범위, 형태 및 크기를 실험 노트에 기록하십시오. CCD 카메라를 사용하여 대표적인 시야를 촬영하십시오. 그다음, 필요한 경우 약 400에서 800배 사이의 저배율로 샘플을 관찰하여 그리드의 전체적인 모습을 확인하십시오.

이는 시료 농도, 불균일한 단백질 및 리포좀 분포, 그리고 탄소 필름의 부분적 파손과 같은 문제점들을 드러냄으로써 그리드 제작 상태를 평가하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 저배율 또는 중배율에서 관심 있는 그리드 영역을 확인하십시오. 그다음 고배율을 사용하여 서로 다른 막들의 가능한 배열 상태를 평가하십시오.

이는 2D 결정화 시험의 초기 단계에서 매우 중요합니다. 잘 정돈된 영역을 가진 유망한 단백질 리포좀을 식별하고, 이후 실험에서 재현성을 검증하며, 2D 결정 스크리닝을 위한 최적의 고배율 설정을 결정하기 위해 50,000에서 60,000 x 사이의 배율로 시작하십시오. 2D 결정의 크기와 단위 격자 크기에 따라 고배율 설정은 30,000까지 낮추거나 80,000까지 높일 수 있습니다.

관심 영역의 인접한 위치에서, 관심 영역이 실제로 막(membrane)인지 불확실한 경우에는 약 -400 nm 또는 그 이상으로 디포커스(defocus)합니다. 시료 내에 프로테오리포좀(proteoliposomes)으로 오인될 수 있는 탄소 필름 조각, MICA 또는 기타 아티팩트가 있는지 확인하십시오. 또한 가장자리 부분을 관찰하여 전형적인 막 접힘과 형태를 식별하십시오.

다음으로, CCD 카메라를 사용하여 관심 영역을 검사합니다. 최적의 고배율 설정에서 CCD 이미지를 수집할 때, 크기가 작거나 대부분 소수성인 막 단백질의 격자는 CCD 이미지 자체의 시각적 평가만으로는 관찰되지 않을 수 있습니다. 이 경우, 전체 이미지를 온라인 푸리에 변환(Fourier transform) 또는 FT에 사용합니다.

하지만 정렬된 배열의 크기가 작은 경우, 이 FT에는 상당한 양의 노이즈가 포함될 수 있습니다. 신호 대 잡음비를 개선하려면 박스 이미지 크기를 줄이고, 축소된 박스를 이미지 위로 이동시킨 후 라이브 FT를 수행하며, 정렬된 배열을 최적으로 식별할 수 있도록 라이브 FT의 감마 함수를 조정하십시오. 감마 값이 너무 높으면 노이즈의 영향으로 스팟이 가려질 수 있으며, 값이 너무 낮으면 약한 스팟을 식별할 수 없게 됩니다. 음성 염색된 2D 결정의 분해능은 DFO -400 nanometers에서 대략 15 angstroms가 될 것으로 예상하십시오.

한 개에서 세 개의 차수를 가진 스폿들을 확인할 수 있을 것입니다. 스폿의 선명도와 모자이크 패턴의 유무를 확인하십시오. 크기가 작은 18 kilodalton 막 단백질의 2D 결정은 크기가 최대 수 µm에 달합니다.

FTS의 반점들이 선명하고 라이브 FT 박스의 움직임이 쉽게 식별된다는 것은 격자가 모자이크 없이 연속적임을 보여줍니다. 더 넓은 가용성 도메인을 가진 더 큰 단백질의 격자는 T-E-M-C-C-D 이미지 수집의 작은 화면에서 식별할 수 있으며, 무질서한 단백질의 FT에서 나타나는 모자이크 노이즈와 같은 특성을 포함하여 격자 품질을 더 정확하게 평가하기 위해서는 FT가 필요합니다. 리포좀을 약한 반점으로 오인할 수 있으므로, 해당 반점이 작은 단백질 2D 결정에 의한 것인지 아니면 노이즈인지 판단해야 합니다.

라이브 ft를 위해 박스를 이동시키십시오. 반점들이 즉시 사라지면 이는 노이즈이지만, 아주 작은 영역에서라도 변화 없이 유지된다면 결정이 존재할 가능성이 높습니다. 지질 결정은 뚜렷한 형태와 ft를 나타내기 때문입니다. 이러한 지질 결정은 이미지의 시각적 검사와 일관된 단위 세포 크기를 통해 확인할 수 있습니다.

초기 실험에서는 침전이 발생할 수 있습니다. 고배율 검사를 통해 단백질 침전과 지질 응집체를 구분합니다. 지질 응집체의 경우, 실제로 재구성이 일어났을 수 있으며, 다음 실험에서는 재구성을 유도하기보다는 막 크기를 증가시키고 질서를 생성하는 데 필요한 매개변수만 30,000~50,000 x에서 조정하면 됩니다.

이러한 어두운 구조의 가장자리를 통해 단백질이 없는 막으로 구성되어 있음을 알 수 있습니다. 최적의 조건에서 침전된 샘플에는 높은 비율의 2D 결정이 포함됩니다. 데이터 수집을 위해 가장 크고 질서 정연한 2D 결정을 시각적으로 선택하므로, 막이 균일한 외관을 갖추도록 할 필요는 없습니다.

이러한 유형의 샘플은 결정화 상태를 쉽게 식별할 수 있어, cryo EM 데이터 수집 시 최대 수의 고해상도 이미지를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 본 절차에서는 TEM을 이용하여 소형 막 단백질의 2D 결정을 스크리닝하는 방법을 보여드리겠습니다. 이미 상당한 시간과 노력을 투자한 상태이므로, 유망한 결정화 조건을 간과하지 않도록 철저하게 확인하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.