활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

안녕하세요, 저는 예루살렘 히브리 대학교 의학 신경생물학과의 Dr.Review Klar 연구실 소속 Ham입니다. 안녕하세요, 저는 Sophie Esman이며 저 또한 Lars 연구실 소속입니다. 오늘은 In vivo 전기천공법 및 척수 오픈북(open book) 표본 제작 절차를 보여드리겠습니다.

저희 실험실에서는 배아 척수 내 유전적으로 정의된 신경세포군(neuronal population)의 축삭 궤적을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 수정한 화이트 레그혼(white leghorn) 계란을 상온에서 37~38 °C의 가습 인큐베이터(가급적 흔들림 쟁반이 있는 것)로 옮기십시오.

생존 가능하고 동기화된 배아를 얻기 위해서는 인큐베이터의 온도와 습도를 모니터링하는 것이 중요합니다. 병아리 배아가 hamburger and Hamilton 또는 HH stage 18에서 20 단계에 도달했을 때 전기천공법을 시행하며, 이 단계는 인핸서 의존적 특이적 발현을 위한 최적의 단계입니다. 이 단계에서 머리는 몸통과 직각을 이룹니다.

또한 HH 단계 18에서 20 사이에는 전방 및 후방의 좌우 vital line vessel과 같은 방대한 세트의 배외 혈관들이 관찰되어야 합니다. 병아리 배아는 66시간의 배양 후 HH 단계 19에서 20에 도달하며, 이때 인큐베이터에서 알을 꺼냅니다. 알을 꺼낸 후, 수평으로 놓은 상태에서 5분에서 10분 동안 기다립니다. 이제 배아는 알의 상극(upper pole)에 위치하게 됩니다.

전기천공법을 실시하기 전, mL당 100 unit의 페니실린과 mL당 0.1 mg의 스트렙토마이신이 포함된 Hank's 용액을 준비합니다. µL당 2~5 µg 농도로 원하는 DNA 혼합물을 준비하고, 주입된 DNA를 쉽게 시각화할 수 있도록 fast green 염료를 소량 첨가합니다. 또한 마우스 피펫, 멸균 주사바늘, 작은 가위 및 테이프를 함께 준비합니다.

피펫 풀러를 사용하여 직경 0.5 millimeter 유리 모세관을 당겨 마이크로 모세관을 준비합니다. 텅스텐 전극을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고 전극을 펄스 발생기에 연결합니다. 펄스 발생기의 전압을 minus 30 volts로, 각 펄스의 길이를 50 milliseconds로, 펄스 횟수를 3회로 설정합니다.

배아를 노출시키고 다루기 전에 전기천공법을 진행하십시오. 주사기를 알의 좁은 극단에 삽입하여 각 알에서 5~6 mL의 알부민을 제거합니다. 알부민은 쏟아지는 것을 방지하기 위해 제거합니다.

다음 단계에서 절단할 때, 작은 가위를 사용하여 절단하십시오. 병아리 배아를 노출시킨 후 달걀 상단에 타원형 창을 내고, 0.5~1 mL의 hanks 및 penicillin streptomycin 용액으로 적셔줍니다. 그다음, 마우스 피펫을 사용하여 유리 마이크로 모세관을 충전합니다.

DNA 염색약 혼합물을 사용하여 적절한 직경의 마이크로 모세관에 DNA를 쉽게 로딩해야 합니다. 실체 현미경 하에서 신경관에 DNA를 주입할 배아의 위치를 잡습니다. 배아의 꼬리 부분이 사용자 쪽을 향하도록 배치하십시오.

이 발달 단계에서는 척수가 명확하게 보이기 때문에 별도의 대조 염색 기술이 필요하지 않습니다. 척수는 머리 쪽과 꼬리 쪽 끝이 밀폐되어 있습니다. 하지만 미세 모세관으로 천자하여 신경관에 구멍을 내고 얕은 각도로 관통시킬 때, 충분히 가늘고 적절한 직경을 가진 미세 모세관을 사용해야 신경관을 손상시키지 않고 관통할 수 있습니다.

마우스 피펫(mouth pipette)을 사용하여 DNA를 주입합니다. 적절한 직경의 마이크로 모세관을 사용하여 일정한 호흡으로 DNA를 방출시켜야 합니다. 녹색 염료가 꼬리 끝에서부터 발달 중인 뇌의 뇌포(vesicles)까지 퍼져 나가야 합니다.

신경관이 가득 찰 때까지 주입하십시오. 주입된 DNA가 세포 내부로 진입하기 위해서는 DNA 전기천공법이 필요합니다. 먼저, 전극을 신경관과 평행하게 배치하고, 신경관 자체에 닿지 않도록 최대한 가까이 둡니다. 펄스 동안 전기 전도성이 확보될 수 있도록 전극이 액체에 잠겨 있는지 확인하십시오.

일반적으로 배아를 노출시킨 직후에 Hank 용액을 첨가하는 것으로 충분합니다. 하지만 그렇지 않은 경우에는 전극을 배치하고 액체에 담근 상태에서 펄스를 가하기 직전에 Hank 용액 한 방울을 첨가하여 전기 조작을 수행한 다음, 전극을 조심스럽게 제거하고 테이프로 윈도우와 난자를 밀봉합니다. 이후 배양 기간 동안 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 난자를 완전히 밀봉하는 것이 중요합니다.

알을 다시 인큐베이터에 넣고 병아리 배아가 발달 단계인 배아 6일 차(E6)에 도달할 때까지 배양합니다. 전기천공법이 시행된 배아가 발달 단계인 배아 6일 차(E6)가 되어 이미징을 할 때가 되면, 전기천공 3일 후인 E6에 미세 가위를 사용하여 배아를 알에서 꺼내 PBS가 담긴 실리콘 코팅 페트리 접시에 옮깁니다.

막을 제거하고, 핀을 실리콘에 박아 고정하여 배아의 복측이 위로 오도록 팽팽하게 폅니다. 날카로운 텅스텐 마이크로 모세관을 사용하여, 후뇌부터 꼬리까지 지붕판(roof plate)을 따라 세로로 절개합니다.

척수의 양측에 두 개의 세로 절개를 추가로 가하여, 등쪽뿌리신경절(DRG)을 척수에서 분리합니다. 꼬리 부분부터 후뇌까지 바닥판(floor plate)을 조직에서 분리하되, 척수는 손상되지 않도록 유지합니다. 마지막으로 미세 가위를 사용하여 후뇌 부위에서 척수를 횡단면으로 절단하고 척수를 몸체에서 분리합니다.

척수를 분리했으므로, PBS가 담긴 새로운 실리콘 코팅 페트리 접시에 척수를 펼치고, 핀을 사용하여 후뇌부터 꼬리까지 고정함으로써 평면 마운트 표본을 제작합니다. 척수를 PBS 내 4% 파라포름알데히드에 넣고 상온에서 1시간 동안 고정합니다. 척수를 펼친 상태로 마운트하기 위해, 상세히 안내된 면역조직화학법 서면 프로토콜에 따라 면역 염색을 수행합니다. 이후 이미징을 위한 표본 준비를 마칩니다.

슬라이드 위에 그리스 또는 실리콘을 직사각형 모양으로 도포하고, 그 직사각형 내부에 PBS를 떨어뜨립니다. 핀셋을 사용하여 척수를 직사각형 중앙에 펼쳐서 배치하고, 주변의 액체를 제거합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 마운팅 용액 1~2방울을 척수 위에 떨어뜨린 후 커버슬립으로 덮습니다.

커버 슬립에 압력을 가합니다. 공기 방울이 생기지 않도록 주의하십시오. 슬라이드는 4 °C의 암소에 보관하십시오.

공초점 현미경을 사용하여 척수를 관찰합니다. 다음은 대조군 실험에서 나타난 병아리 척수 중간뉴런의 축삭 투사 결과의 대표적인 예시입니다. CMV의 보편적 인핸서 요소를 이용하여 모든 뉴런에서 RFP가 발현되었으며, 대부분의 뉴런과 그 축삭들이 표지되었습니다. 이러한 경우 뉴런 하위 집단의 축삭 경로를 판별하는 것은 불가능합니다.

하지만 특정 강화 요소를 적용하면, 본 예시의 특정 하위 집단인 DI two 뉴런의 정의된 축삭 경로가 드러납니다. 지금까지 E 3 단계에서 특정 뉴런 강화제를 사용하여 닭의 신경관을 전기적으로 조작하는 방법과 E 6 단계에서 개방형 척수를 준비하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 주의 깊고 인내심 있게 작업해야 함을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 행운을 빕니다.