T - 파 이온 모빌리티 분석법 - 질량 : 단백질 복잡한 분석을위한 기본 실험 절차

다음 실험의 일반적인 목적은 단백질 복합체의 전체적인 형태를 결정하는 것입니다. 이는 단백질 복합체 이온의 질량 분석 이온 이동도 데이터를 획득하고 각 전하 상태의 드리프트 시간 값을 측정함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 천연 단백질 구조의 이동도 측정이 보장되도록 실험 조건을 검증합니다.

다음으로, 측정된 드리프트 시간 값을 단면적과 상관 분석합니다. 그 결과로 3차원 구조가 알려지지 않은 단백질 또는 단백질 복합체의 충돌 단면적 값을 결정합니다. 이 정보는 이들의 전체적인 모양, 하위 단위체의 패킹 및 위상에 대한 단서를 제공합니다.

안녕하세요, 저는 와이즈만 과학 연구소 생물화학과의 Mic 연구실 소속 Isaac Leski이며, 저와 함께하신 분은 역시 Mic 연구실 소속인 Naam Kirschenbaum입니다. 오늘은 하이브리드 질량 분석법과 이온 이동도 장비를 사용하여 단백질 복합체의 충돌 단면적을 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 단백질 복합체의 전체적인 모양과 구조적 조직을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 본 절차는 단백질 복합체의 이온 이동도 질량 분석법 또는 IMM MS 분석에 중점을 둡니다. 시료 준비 단계, 기기 보정, MS 및 탠덤 MS 최적화 절차는 관련 JO 프로토콜에서 설명되어 있습니다.

일반적으로, 이 프로토콜은 아세트산 암모늄과 같은 휘발성 완충액에 포함된 저마이크로몰(low micromolar) 농도의 복합물을 사용합니다. 나노 흐름 모세관당 1~2 µL가 소모되므로, MS 조건 최적화가 가능하도록 최소 10~20 µL를 준비하십시오. 이 절차를 시작하려면, traveling wave 또는 T-wave synap IMMS를 다음과 같은 작동 모드로 설정하십시오. tri-wave와 압력이 IM 및 이온의 시간 비행 분리를 위해 자동으로 설정되는 mobility tof 모드, 양이온 획득 및 V 모드로 설정하여 이온이 비행 튜브와 반사 장치를 통과하는 경로를 지정하고, 모든 가스를 켭니다.

IM 분리에는 질소를, 트랩 및 전송 영역에는 아르곤을 사용합니다. 권장 초기 설정값은 IMS 장치의 가스 유량 24 milliliters per minute, 트랩 영역의 가스 유량 1.5 milliliters per minute입니다. 그다음, 미지의 단백질 복합체에 대한 질량 대 전하비 획득 범위를 설정하십시오.

초기에는 넓은 질량 범위를 사용하고, 이후 원하는 값으로 범위를 좁히면서 MS 프로파일을 적절히 조정하십시오. 거대 복합체의 전송 효율을 최대화하려면, 획득 질량 범위를 1030 2000 m/z로 설정하고 MS 프로파일을 auto로 설정해야 합니다. 그 외의 경우에는 표시된 차트에 따라 프로파일을 설정할 수 있습니다.

RF 설정을 확인하고, 필요한 경우 표시된 대로 대형 단백질 복합체에 적합한 값으로 조정하십시오. 다음으로 샘플을 로딩하고 모세관 전압과 낮은 나노 유량 압력을 가하십시오. 분무가 시작되면 나노 유량 압력을 최소값으로 낮추십시오.

또한, 콘에 대한 모세관의 위치를 조정하고, 잘 분해된 MS 스펙트럼을 얻기 위해 MS 획득 파라미터를 조정하십시오. 관련 JoVE 프로토콜에 상세히 설명된 대로, 기기와 샘플링 콘을 따라 압력 구배를 최적화하고 추출 콘 바이어스 트랩 및 전송의 전위 설정을 최적화하십시오. 이러한 파라미터는 샘플에 따라 달라지지만, 여기에는 펩타이드부터 단백질 복합체에 이르기까지 다양한 철 질량의 MS 스펙트럼을 획득하는 데 사용된 조건이 제시되어 있습니다.

거대 이온은 더 높은 충돌 에너지와 바이어스 전압을 필요로 합니다. 또한 거대 단백질 복합체를 분석할 때는 복합체의 활성화를 최소화하기 위해 배압(back pressure)을 높이는 것이 권장됩니다. 피크의 위치가 변하지 않는 범위 내에서 샘플 콘 추출(sample cone extraction), 콘 트랩(cone trap) 및 바이어스 전압을 약 10V씩 단계적으로 낮추어 보십시오.

최적의 질량 분석 스펙트럼을 얻은 후, 단백질 복합체를 분석할 때는 드리프트 시간 또는 IM 프로파일을 조정해야 합니다. 질량 및 이동도 측정 모두를 위한 최적 조건은 서로 호환되지 않는 경우가 많습니다. 따라서 이 두 가지 사이의 적절한 균형을 맞추는 것이 중요합니다.

전반적으로, 피크가 전체 드리프트 시간 범위에 걸쳐 분포하고 피크 프로필이 매끄럽게 나타나도록 철 이동도 플롯을 최적화해야 합니다. 가우시안 분포에 근접했을 때 나타나는 상당한 피크 비대칭성은 여러 컨포메이션의 불충분한 분리와 관련이 있을 수 있습니다. 이동도 분리를 최적화하기 위해 T-wave 속도, T-wave 높이 및 IMS 가스 유량을 조절할 수 있습니다. T-wave 속도를 높이면 드리프트 시간 분포 프로필이 넓어집니다.

T-wave 높이 값이 증가하면 좁아지는 반면, IMS 가스 유량을 최소 10 milliliters per minute부터 비슷하게 증가시키면 드리프트 시간 프로필이 더 높은 값으로 이동하므로, 이온 이동도 스펙트럼을 최적화하는 작업이 필요합니다. 세 가지 변수 중 두 가지를 고정하고 세 번째를 최적화하기 위해, T-wave 속도를 250 meters per second로, 가스 유량을 24 milliliters per minute로 설정하십시오. 그런 다음 시작점으로 높이를 3 volts로 설정하고, 1 volt씩 단계적으로 증가시키십시오.

높은 바이어스 전압을 사용하는 경우, IMS 가스 압력을 낮추어 바이어스 전압을 감소시키는 것이 권장됩니다. 결과적으로 복합체의 활성화 및 해리가 감소하게 됩니다. 조건이 최적화되지 않았을 때 롤오버 효과(rollover effect)가 나타날 수 있으며, 이는 드리프트 시간 스펙트럼의 앞부분과 꼬리 부분에서 동일한 피크가 관찰되는 것으로 나타납니다.

이온이 IAM 장치를 통과하지 못하면, 결과적으로 이온의 이동 시간이 다음 이온 패킷이 이동도 셀로 방출되는 데 필요한 시간보다 더 길어질 수 있습니다. 그 결과, 이전 패킷이 푸셔 영역으로 전달되기 전에 트랩 영역에서 새로운 이온 뭉치가 방출됩니다. 이러한 아티팩트를 제거하려면 T-wave 높이를 높이고 T-wave 속도와 IMS 압력을 낮추십시오.

또한, 트랩 방출 시간을 조정할 수 있습니다. 아울러, 전송 T-파의 높이가 최소 5 V로 설정되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이는 IMS 셀 방향으로의 이온 누출을 방지하기 위함이기도 합니다.

이동도 트랩 높이는 최대 수준으로 유지해야 합니다. 낮은 속도와 높은 진폭의 전송 T-wave는 드리프트 시간 분포 프로파일의 리플링(rippling) 현상을 유발할 수 있습니다. 이러한 아티팩트는 푸셔(pusher) 주파수와 전송 T-wave 속도 사이의 부분적인 동기화로 인해, 전송 및 터프(tough) 영역을 통과하는 동안 이온의 이동도 분리가 유지되지 않을 때 발생합니다.

이러한 영향을 제거하려면 푸셔 시간(pusher time) 또는 전송 T-파 속도(transfer T-wave velocity)를 조정해야 합니다. 푸셔 주파수는 질량 범위와 관련이 있으므로, 이 파라미터가 변경될 때 해당 아티팩트가 다시 나타날 수 있습니다.

T파 높이는 미미한 영향을 미칩니다. 하지만 T파 높이를 낮추면 리플(ripple) 현상을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 앞서 언급한 파라미터들이 최적화되면, 고해상도의 IMMS 데이터를 획득할 수 있습니다.

MS.Peaks 단백질 복합체는 잔류 수분 및 완충액 성분의 제거를 촉진하기 위해 질량 분석기 내에서 흔히 활성화됩니다. 그러나 활성화 에너지가 임계값을 초과하여 증가하면 부분적인 언폴딩이 발생하여 여러 중간 상태가 형성될 수 있으며, 이는 천연 용액 상태의 구조와 일치하지 않을 가능성이 높습니다. 그 결과, 드리프트 시간 피크가 이동하거나 넓어질 수 있으며, 이는 언폴딩된 구조의 불균일한 집합을 반영합니다.

용액상 구조와 일치하는 드리프트 시간 데이터를 얻기 위해서는 IM 분리 전 이온 가속에 사용되는 전압을 세심하게 제어하는 것이 필수적이므로, 드리프트 시간 스펙트럼에 미치는 영향을 모니터링하면서 모세관 전압과 콘 전압을 단계적으로 높여야 합니다. 또한, 높은 MS 분해능을 위해서는 트랩 전압보다 전송 전압을 높이는 것이 바람직합니다. IM 장치는 전송 영역과 TOF 분석기 앞에 순차적으로 배치됩니다.

활성화 과정이 IM 측정 이후에 이루어지므로 IM에는 영향을 미치지 않는 반면, MS 정확도는 높여 복합체의 천연 구조가 유지되는 조건에서 데이터 수집이 수행되도록 보장할 수 있으므로, 단일하게 최적화된 매개변수 세트에 집착하기보다는 다양한 실험 및 용액 조건 범위에서 데이터를 수집하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로, 트랩 충돌 전압을 단계적으로 높이면서 10 volt 간격으로 데이터를 수집하고, 철 이동도 프로필에 미치는 영향을 모니터링하십시오. 마지막으로, 풀린 구조(unfolded confirmations)를 식별하고 수집된 데이터를 평가하기 위해, 시료에 아세트산을 적정하여 pH 2에서 7 범위에서 단백질 복합체의 해리를 수동으로 유도하고 데이터를 기록하십시오. 이후 T-wave IMS 시스템에서 데이터를 분석하며, 단면적 값(cross-section values)을 알고 있는 표준 단백질을 이용한 드리프트 시간 교정법으로 정의된 단면적을 산출하십시오.

먼저, 각각 10 µM 농도의 변성 표준 단백질 용액을 준비합니다. 말의 cytochrome C, 말 심장 myoglobin 및 소 ubiquitin을 물, 메탄올, 아세트산이 49:49:0.2 부피비로 혼합된 용액에 사용하십시오. 다음으로, 표적 단백질 또는 단백질 복합체에 사용된 것과 정확히 동일한 기기 조건에서 표준 단백질의 IMMS 데이터를 획득하며, IM 분리 설정을 유지하기 위해 모든 전압과 압력 값을 동일하게 유지하십시오.

데이터를 획득한 후, 각 전하에 대한 실험적 드리프트 시간 값을 추출하십시오. 보정된 드리프트 시간 T prime D를 다음 방정식을 사용하여 수정하십시오. 여기서 MOVZ는 관찰된 이온의 마스터 전하비이며, C는 향상된 듀티 사이클(EDC) 지연 계수입니다. 이 값은 일반적으로 1.4에서 1.6 사이이며 기기에 따라 달라집니다.

EDC 값은 system one acquisition settings의 one acquisition setup 탭에 표시되며, 철 전하 상태와 환산 질량 모두에 대해 각 교정 단면적을 보정합니다. 여기서 omega C는 보정된 단면적, omega는 문헌 단면적, Z는 철 전하 상태, M은 체인 이온의 분자량, MG는 철의 분자량입니다.

일반적으로 질소인 배경 가스에서, T'D에 대한 plop thelan을 omega C에 대한 thelan으로 플롯합니다. 결과 곡선은 다음 방정식에 해당합니다. 매개변수 X와 A는 플롯을 선형 관계로 피팅하여 추출할 수 있습니다. 기울기 X는 지수 비례 계수에 해당하며, A는 피팅으로 결정된 상수를 나타냅니다.

적합 상관 계수 R squared를 계산하십시오. R squared의 허용 값은 0.95보다 커야 합니다. 상관 계수 값이 더 낮게 나타나는 것은 단백질의 불완전한 언폴딩이나 시료의 노후화로 인한 것일 수 있습니다.

서로 다른 크기의 단백질에 사용된 상이한 실험 조건, 노이즈가 많은 스펙트럼, 불완전한 데이터 처리 또는 계산 오류 등이 원인일 수 있습니다. 결정된 지수 인자 X를 사용하여 ca 드리프트 시간을 보정하고, omega C와 T prime D의 관계를 다시 도식화하여 계산 결과를 검증하십시오. 상관 계수를 다시 정의하십시오. 이전 단계에서 설명한 것과 유사하게 0.95보다 높은 값이 예상됩니다. 표적 단백질 또는 단백질 복합체의 측정된 드리프트 시간을 보정하고, 계산된 지수 인자 X를 사용하여 표적 단백질 또는 단백질 복합체의 드리프트 시간을 교정하십시오. 피팅으로 결정된 상수 A를 사용하여 표적 단백질 또는 단백질 복합체의 omega를 계산하며, 이때 omega는 a TD와 같습니다. 각 실험 조건에 대해 이 단계들을 반복하십시오.

미지의 단백질 또는 단백질 복합체의 단면적을 정의할 때, 각 실험을 최소 3회 반복하고 충돌 단면적 값이 결정되면 이 3중 측정값의 표준 편차를 산출할 것을 권장합니다. 복합체의 위상 또는 배열을 예측하기 위해 모델링 접근법이 활용됩니다. 이는 실험적으로 얻은 충돌 단면적 값을 생성된 모델 구조로부터 계산된 in silico Omega 값에 피팅함으로써 수행됩니다. 전반적으로 이 분야는 아직 초기 단계에 있으며, 이 접근법을 일반화하여 광범위한 복합체에 적용하기 위해서는 추가적인 발전이 필요합니다.

소 혈색소(hemoglobin)의 4량체 형태의 표면 표현이 여기에 제시되어 있습니다. 산소 운반체인 혈색소 복합체는 앞서 언급한 접근 방식의 예시가 될 수 있습니다. 혈색소는 각각 파란색과 빨간색으로 표시된 두 개의 알파 및 두 개의 베타 하위 단위로 구성된 4량체 단백질 복합체이며, 이는 알파-베타 이량체의 이량체 형태를 이룹니다.

헤모글로빈의 IMMS 스펙트럼이 여기에 제시되어 있습니다. 획득한 복합체의 IM ms 스펙트럼을 보면 온전한 복합체에 해당하는 주요 전하 시리즈 분포와 알파 베타 이량체 및 알파 및 베타 단량체 하위 단위의 질량과 일치하는 소수 전하 시리즈가 나타납니다. 헤모글로빈의 다양한 형태에 대한 이론적 및 측정된 CCS가 여기에 제시되어 있습니다.

이량체 및 사량체 형태의 여러 전하 상태에 대해 얻은 드리프트 시간 값을 사용하여 오메가 값을 계산하였습니다. 이를 이론적 값과 비교하였습니다. 사량체 복합체는 고리형, 이면각형 또는 사슬형 패킹의 세 가지 결합 가능성이 있다는 점이 고려되었습니다.

이량체(dimer)에서 사량체(tetramer)로 전환될 때의 omega 증가량을 계산함으로써 구조적 조직을 예측할 수 있습니다. 이전 연구와 본 실험팀의 실험 결과, 측정된 ccss와 결정 구조 데이터로부터 도출된 단백질 표면적 사이에 강한 상관관계가 있음이 밝혀졌습니다. 이러한 상관관계를 이용하면 다양한 패킹 형태에 따라 이량체 대비 사량체에서 예상되는 표면적 증가량을 계산할 수 있습니다.

이는 각 서브유닛을 비구형 객체로 간주함으로써 수행됩니다. 사슬 형태의 조립은 4량체 CCS를 약 2배 증가시키는 반면, C4 또는 D2 패킹은 각각 약 1.5배와 1.67배의 증가를 가져옵니다. 헤모글로빈의 4량체 형태와 DME 형태의 측정된 CCS 값 사이의 계산된 비율은 1.57 ± 0.03이었습니다.

이 수치는 천연 구조가 선형으로 조직되어 있지 않고, 고리형 또는 이면체 사량체(dihedral tetramer)와 같이 더 조밀한 형태로 배열되어 있음을 보여줍니다. 분석된 헤모글로빈의 결정 구조에 대해 동일한 계산을 반복했을 때, 사량체와 DME 형태의 표면적 비율은 1.63이었으며, 이는 D2 대칭에 부합합니다. 분명히 이 기하학적 모델은 단순화된 것이며 단백질 하위 단위가 단순히 구형인 것은 아닙니다.

하지만, 이러한 계산은 고해상도 구조가 알려지지 않은 복합체의 패킹 상태를 밝혀내는 데 있어 IMMS가 가진 흥미로운 잠재력을 보여줍니다. 지금까지 단백질 및 단백질 복합체의 드리프트 시간을 측정하는 방법과 그에 따른 충돌 단면적 값을 계산하는 방법을 설명해 드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 표준 단백질에 대한 IMMS 데이터를 표적 단백질 또는 단백질 복합체에 사용한 것과 정확히 동일한 조건에서 획득하는 것이 중요합니다.

또한, 이러한 실험을 최소 3회 반복하고, 3회 반복 측정값의 표준 편차를 결정할 것을 강력히 권장합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.