동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

본 실험의 전반적인 목적은 토마토 식물의 산화환원 조절 단백질에 미치는 pseudomona siro PV tomato의 영향을 관찰하는 것입니다. 먼저, 병원균 감염과 단백질 반응을 유도하기 위해 토마토 식물에 pseudomona siro PV PV tomato를 접종합니다. 이어서 DIAM benzine으로 염색하여 활성 산소종의 변화를 관찰합니다.

그 다음, 단백질 내의 산화환원 조절 시스테인을 분석하기 위해 시스테인 TMT 표지를 수행합니다. 이를 통해 얻은 결과로 처리군과 대조군 샘플 간의 변화를 측정할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 플로리다 대학교 생물학과 단백질체학 시설의 Chen입니다.

ASCA로도 알려진 동위원소 코팅 핀 태그와 같은 기존 방법과 비교하여 본 CTMT 태깅의 장점은 대규모로 산화환원 응답성 단백질을 분석하는 동시에 다중 분석이 가능하다는 점입니다. 본 시연은 병원균 감염에 반응하는 토마토의 산화환원 조절 단백질에 대한 통찰을 제공하겠지만, 이 실험은 조류, 생쥐, 다른 식물 및 스트레스 조건 제어와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 저희는 단 두 개의 태그만 사용할 수 있어 ICAD 실험 간에 뚜렷한 편차가 발생하는 것을 관찰한 후 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.

라벨링 및 농축 단계는 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 VIR 시연이 매우 중요합니다. 효율적인 라벨링을 위해 라벨링된 샘플 간의 실험적 변동을 최소화하고 제거되는 부위를 줄여야 합니다. 이제 시작하겠습니다. 접종 배양을 위해 유사한 크기의 이식된 토마토 묘 2개를 지름 4인치 화분에서 재배하십시오.

KBM 플레이트 상의 *Pseudomonas* single lawn입니다. 박테리아를 긁어 20 milliliters의 물에 넣고, milliliter당 약 10⁶ colony forming units 정도의 박테리아 접종액을 준비합니다. 1 liter의 접종 완충액에서 4주 된 식물을 박테리아 접종 용액에 30초 동안 담급니다.

그런 다음 즉시 투명 플라스틱 백으로 덮습니다. 원하는 접종 시간이 지나면, 완전히 전개된 잎을 수확하여 표피 쪽이 위로 향하게 하여 1 mg/mL DAB 염색액에 넣고 15분 동안 진공 침투시킵니다. 이후 잎을 실온의 암소에서 하룻밤 동안 배양합니다.

이제 염색된 잎을 95% ethanol에서 10분 동안 끓인 후 75% ethanol에 보관하십시오. 수확한 잎을 액체 질소에서 막자를 사용하여 미세한 분말로 갈아냅니다. 그다음 동봉된 텍스트에 설명된 대로 페놀 추출을 수행합니다.

다음으로, 100% methanol 내의 차가운 0.1 molar ammonium acetate 5배 부피를 사용하여 페놀 추출 단백질을 침전시킵니다. 원심분리로 단백질을 회수한 후, 펠렛 세척을 수행합니다. 그 다음 시료를 차가운 70% ethanol 1.5 milliliters에 재현탁하여 2 milliliters 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

원심분리 후, 에탄올 상층액을 버리고 스피드백(speed vac)으로 펠릿을 짧게 건조합니다. 변성 단백질 추출 버퍼에 샘플을 용해한 후, 원심분리하여 펠릿을 형성시키고 상층액을 수집하여 제조사 매뉴얼에 따라 단백질 농도를 측정합니다. 6개의 질량 태그 각각에 대해, 100 µg의 단백질 샘플을 갓 준비한 200 mM IO 아세트아미드 알킬화 버퍼와 동일한 부피로 혼합하여 유리 티올기를 차단하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 단백질을 침전시키기 위해 차가운 80% 아세톤 1 mL를 첨가하고 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다.

원심분리를 통해 단백질을 펠렛화하고 80% acetone으로 3회 세척합니다. 얼음 위에서 시료를 공기 건조시킨 후, 펠렛을 50 µL의 lysis buffer에 다시 현탁합니다. 그 다음, 이황화 결합을 환원시키기 위해 100 mM TCEP 0.5 µL를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

시약 튜브에 아세토니트릴 20 µL를 첨가하여 태그를 가용화합니다. 볼텍싱 후 원심분리하여 침전시킵니다. 다음으로, 과량의 TCEP를 제거하기 위해 50 µL의 시료를 MicroCon 3 KD 컬럼에 로딩합니다. 용해 버퍼 50 µL를 첨가하고 4 °C에서 10,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다.

시료를 수집하려면 컬럼을 제거하여 깨끗한 튜브에 뒤집어 넣고 원심분리합니다. 필요에 따라 시료의 pH를 확인하십시오. 1 M 염산을 사용하여 pH 7에서 8 사이로 조정합니다.

TMT 시약 5 µL를 추가하고 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 샘플들을 혼합하고 동일한 부피의 lysis 샘플 버퍼를 추가하여 5분간 가열합니다. 이후 precast 12% polyacrylamide 젤에서 분리합니다. 필터링된 물로 젤을 3회 세척한 후 Coomassie Blue로 1시간 동안 염색하고, 단백질 밴드 농도에 따라 물에서 하룻밤 동안 탈색합니다. 젤 레인당 12개의 분획으로 나눕니다. 각 분획을 1 mm 크기로 절단하여 1.5 mL 튜브에 넣습니다.

0.1 M 암모늄 바이카보네이트와 50% 아세토나이트릴 혼합액에 겔 조각들을 완전히 담급니다. 그다음 100% 아세토나이트릴로 조각들을 15분 동안 덮어줍니다. 액체를 제거하고 speed vac을 사용하여 조각들을 건조시킵니다.

다음으로, 동일한 부피의 tripsin 용액을 첨가하고 얼음에 두어 재수화시킵니다. 그 다음, trypsin 소화를 위해 37 °C에서 12~16시간 동안 배양합니다. 이어서, 배양된 샘플에서 액체 단백질 추출물을 제거합니다.

5% formic acid와 50% acetonitrile로 겔 조각을 덮어 반응을 중단시키고 남은 단백질 소화물을 제거합니다. 그다음 실온에서 20분 동안 겔 조각을 흔들어줍니다. 이 과정을 두 번 더 반복하여 추출한 후 상층액을 단백질 샘플 추출 튜브로 옮깁니다.

0.5 milliliter 튜브에 담긴 시료를 speed vac으로 건조합니다. 각 단백질 밴드의 강도에 비례하는 농도로 TBS 내에 anti TMT resin 50% 슬러리를 준비합니다. resin을 1배 TBS 1컬럼 부피로 3회 세척한 후, 각 시료에 200 microliters의 TBS를 첨가합니다.

그런 다음 anti-TMT 수지로 옮겨 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 4°C에서 하룻밤 동안 쉐이킹(rocking)합니다. 각 샘플을 컬럼에 로딩합니다. 200 µL씩 컬럼 세척을 수행합니다.

그 다음, 각 샘플을 200 µL의 50% 용출 완충액으로 3회 용출하고 진공 상태에서 건조합니다. 샘플을 0.1% formic acid가 포함된 3% acetonitrile 12 µL에 현탁시킨 후, 5 µL를 HPLC 컬럼에 직접 주입합니다. 첨부된 텍스트에 상세히 기술된 바와 같이, acetonitrile 농도를 높이는 구배(gradient)를 사용하여 펩타이드를 용출합니다.

top two by three 워크플로우에서 질량 분석법을 사용하여 펩타이드를 검출하십시오. 단일 단계 ms로 시작합니다. 그런 다음 고에너지 C trapped dissociation 단편화를 통해 3개의 Ms.Ms 스펙트럼을 획득하고 이어서 3개를 수행합니다.

단백질 식별을 위해 충돌 유도 해리(collision induced dissociation)를 이용한 Ms.MS를 수행합니다. 분기형 워크플로우를 사용하여 질량 분석 데이터를 분석합니다. 비율을 정량화하기 위해 리포터 철 정량기(reporter iron quantizer)를 구현합니다.

또한 MSM MS 스펙트럼을 스펙트럼 선택기(spectrum selector), 스펙트럼 정규화기(spectrum normalizer) 및 스펙트럼 그룹화기(spectrum grouper) 노드를 통해 처리하고 seaquest 검색 엔진을 통해 데이터를 쿼리하십시오. 이 이미지는 DAB로 염색한 후, 왼쪽의 대조군 토마토 식물 잎과 오른쪽의 pseudomonas를 접종한 잎의 예를 보여줍니다. DES 염색 과정은 조직 화학적 염색을 통해 잎 조직 내의 활성 산소종의 징후를 나타낼 수 있게 합니다.

예상대로 대조군은 유의미한 염색을 보이지 않는 반면, pseudomonas를 처리한 잎은 과산화수소 생성에 대해 양성으로 염색됩니다. 이 예시는 단백질체 발견 데이터 출력을 보여주며, 각 샘플에 대해 차등적으로 산화환원 조절된 단백질의 피크 면적을 통해 절대 정량이 가능함을 보여줍니다. 대조군과 접종군 샘플 간의 피크 면적은 상대적인 양을 나타냅니다.

여기서 대조군과 접종 샘플 간의 단백질 산화환원 조절은 유사하게 나타납니다. 비슷한 강도의 피크는 처리 변화에 의해 조절되지 않는 이황화 결합의 존재를 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 일주일 이내에 적절하게 수행할 수 있습니다.

샘플을 차갑게 유지하고 라벨을 체계적으로 정리하십시오. 또한, 페놀을 사용할 때는 실험용 장갑을 착용하고 후드 내에서 본 절차에 따라 작업하는 등의 예방 조치를 취하십시오. 오닉산(onic acid) 및 글루타티온 시뮬레이션과 같은 다른 시스템 변형을 결정하기 위해 번역 후 변형에 대한 특정 질량 분석법과 같은 추가 측정법을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 DIB 스탠딩 CTMD 활성화 및 redox 16 퀄리피케이션을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.