아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

아크릴아마이드 하이드로젤을 사용하여 생체 내 조직 순응도를 모델링합니다. 이는 먼저 반응성 하단 커버 슬립과 실리콘 처리된 상단 커버 슬립을 제작함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 아크릴아마이드 하이드로젤을 붓고 생성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 선택한 세포외 기질 단백질을 하이드로겔에 가교시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 세포의 배양 및 분석입니다. 최종적으로 면역형광 현미경, 실시간 정량적 PCR 및 웨스턴 블로팅 분석을 통해 인비트로(in vitro)에서 세포외 기질의 강성 변화가 세포 행동을 어떻게 조절하는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

오늘은 아크릴아마이드 하이드로젤의 제조 및 사용 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 세포 형태, 세포 신호 전달 및 증식을 조절하는 세포외 기질 강성을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

반응성 커버슬립을 제작하여 이 절차를 시작하십시오. 먼저 150 millimeter 페트리 접시의 하단 절반에 파라필름 층을 배치합니다. 그다음 최대 9개의 오토클레이브 처리된 25 millimeter 커버슬립을 파라필름 위로 옮기고 1 milliliter의 0.1 molar 수산화나트륨으로 덮어줍니다.

커버슬립을 3분 동안 배양합니다. 배양 후, 화학 흄후드 내의 진공 라인을 사용하여 수산화나트륨을 흡입 제거합니다. 각 커버슬립에 0.5 milliliters의 3-aminopropyltrimethoxysilane 또는 3-APTMS를 피펫으로 분주합니다. 커버슬립을 3분 동안 배양한 다음 3-APTMS를 흡입 제거합니다. 커버 위에 거품이 형성되는 것을 방지하기 위해 너무 오래 배양하지 않도록 주의하십시오.

처리 후의 커버 글라스입니다. 동일한 접시에서 탈이온수 20 milliliters로 커버 글라스를 한 번 헹굽니다. 곡선 핀셋을 사용하여 접시에서 커버 글라스를 꺼내어, 처리된 면이 위를 향하도록 새로운 150 millimeter 접시로 옮깁니다.

그런 다음 커버슬립을 탈이온수로 다시 세척하고 로커(rocker) 위에 10분 동안 둡니다. 배양 후, 물을 제거하고 두 번 더 세척합니다. 글루타르알데하이드를 사용하기 10분 전까지 모든 A-P-T-M-S를 제거하는 것이 매우 중요한데, 이는 A-P-T-M-S가 글루타르알데하이드와 반응하여 뿌연 흰색 침전물을 남기는 것을 방지하기 위함입니다.

곡선 핀셋을 사용하여 커버슬립을 파라핀이 도포된 깨끗한 접시로 옮기고, 진공 라인을 사용하여 남은 액체를 흡입합니다. 그다음 각 커버슬립이 멸균 탈이온수에 희석된 0.5% glutaraldehyde 0.5 mL로 완전히 덮이도록 하여 APTMS와 polyacrylamide 겔을 가교시킵니다. 화학 흄 후드 내에서 커버슬립을 30분 동안 배양합니다. 그 후 glutaraldehyde 세척액을 흡입하고 커버슬립을 탈이온수로 다시 세척합니다.

그런 다음 커버슬립을 완전히 건조시킵니다. 클로로포름에 포함된 10% surface seal 용액이 들어 있는 50 milliliter Falcon 튜브에 새 커버슬립을 넣고 최소 10분 동안 흔들어 줍니다. surface seal 용액을 따라내고 공기 중에서 건조시킵니다.

하이드로젤 제작을 시작하기 위해, 생물안전작업대(BSC) 내의 Kim wipes 위에 놓인 커버슬립을 준비합니다. 곡선 핀셋을 사용하여 커버슬립의 반응면이 위로 향하도록 하여 생물안전작업대 표면에 테이프로 고정된 파라폼 시트로 옮깁니다. 커버슬립이 파라폼 표면에 평평하게 놓였는지 확인하십시오.

그런 다음, 소량의 NHS를 충분한 양의 toluene에 녹여 saturated hydroxy CIN aide 또는 NHS solution을 toluene으로 준비합니다. 구체적인 실험을 위해, NHS가 더 이상 녹지 않을 때까지 소량의 NHS를 계속해서 첨가합니다. 포화 용액은 보통 탁한 분홍색을 띱니다.

다음으로, 원하는 아크릴아마이드 농도에 도달하도록 아크릴아마이드, BIS 아크릴아마이드, 물 및 PS를 준비합니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 시약을 마이크로 튜브에 넣습니다. 그런 다음 한 번에 하나의 분주량씩 추가합니다.

NHS와 TM me를 첨가합니다. 튜브를 짧게 볼텍싱한 후, 생물안전작업대 내에서 커버슬립당 140 µL씩 세 개에서 다섯 개의 젤에 즉시 분주합니다. 중합이 시작되기 전에 25 mm 실리콘 처리된 커버슬립을 각 젤 위에 빠르게 덮어줍니다.

상단 커버 슬립을 덮어 아크릴아마이드가 하단 커버 슬립을 완전히 덮도록 합니다. 아크릴아마이드가 중합될 때까지 이 샌드위치 구조를 실온에서 배양하여 중합 완료 시점을 확인합니다. 마이크로 원심 분리 튜브에 남은 아크릴아마이드 용액을 확인하십시오.

중합 과정은 단단한 젤의 경우 몇 분 정도 소요되며, 부드러운 젤의 경우 시간이 조금 더 걸립니다. 중합이 완료되면 멸균 장갑을 착용한 상태에서 샌드위치 구조물을 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음 상단 커버 슬립을 중합된 젤 밖으로 걸쳐질 때까지 밀어내어 제거합니다.

그런 다음 커버를 들어 올립니다. 겔을 조심스럽게 분리하고 상단 커버 슬립은 폐기합니다. 이후 하이드로겔이라고 명명할 각 바닥 겔 커버 슬립을 6웰 플레이트에 넣습니다.

다음으로, 6-웰 플레이트의 웰당 2 mL의 인산 완충 식염수(PBS)를 넣습니다. 그런 다음 하이드로젤을 PBS로 세척하고 로커(rocker) 위에서 5분 동안 배양합니다. 이 세척 과정을 2회 반복합니다.

실험을 시작하려면 각 하이드로겔을 2 mL의 피브로넥틴 용액 또는 다른 세포외 기질 단백질로 덮습니다. 단백질이 하이드로겔에 공유 결합할 수 있도록 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, ECM 용액을 흡입하여 제거합니다. 그다음, 무혈청 배지 내의 1 mg/mL 열 활성화 지방산 제거 소 혈청 알부민으로 반응하지 않은 NHS를 블로킹하고 37 °C에서 최소 30분 동안 배양합니다.

배양 후, 하이드로겔을 멸균된 PBS로 한 번 세척하십시오. 다음으로, 태아 송아지 혈청이 포함된 적절한 배양 배지에 세포를 분주하여 하이드로겔 위에 도말하십시오.

확립된 마우스 배아 섬유아세포를 사용합니다. 실험에 필요한 세포의 퍼짐 정도와 합류도(confluence)를 바탕으로 하이드로젤에 파종할 세포 수를 결정합니다. 웨스턴 블롯 및 정량적 PCR 분석에는 약 10⁵개의 세포가 필요합니다.

그다음 해당 세포 유형에 적합한 조건에서 세포를 배양합니다. 배양 기간이 끝난 후, 필요에 따라 세포 단백질 또는 mRNA를 추출합니다.

실험대 위의 파라폼 시트 위에 용해 버퍼(lysis buffer)를 100 µL씩 떨어뜨리되, 각 방울 사이에 약 2~3 cm의 간격을 둡니다. 그다음, 웰에서 하단 커버 슬립을 들어 올려 각 하이드로젤을 조심스럽게 꺼냅니다. 곡선 핀셋을 사용하여 하이드로젤의 세포 면이 아래로 향하게 하여 버퍼 방울 위에 놓습니다.

세포를 용해 버퍼(lysis buffer)와 함께 정확히 1분 동안 배양합니다. 마지막으로, 커버슬립을 제거하고 용해 버퍼를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 또는 RNA를 추출할 때는 각 하이드로겔을 새로운 6-웰 플레이트로 옮기고 웰당 1 mL의 triazole을 첨가합니다.

배양 후 겔을 3분 동안 반응시킵니다. 트리아졸 용액을 제거하여 마이크로 원심분리 튜브에 보관합니다. APTMS 첨가 후 커버슬립을 철저히 세척하는 것은 반응성 커버슬립을 제작하는 데 있어 중요한 단계입니다.

적절하게 세척하고 건조시킨 커버슬립에는 침전물 잔여물이 없어야 합니다. APTMS는 글루타르알데히드와 반응하여 흰색의 탁한 침전물을 형성합니다. 침전물이 발생한 경우 커버슬립을 더 이상 사용할 수 없으므로 전체 과정을 반복해야 합니다.

하이드로젤 형성 및 ECM 단백질 코팅 후, 세포를 파종하여 하룻밤 동안 배양합니다. 염색 결과에서 볼 수 있듯이, 단단한 하이드로젤과 부드러운 하이드로젤에서 세포가 퍼지는 양상에는 뚜렷한 차이가 있으며, 생쥐 배아 섬유아세포는 부드러운 하이드로젤에 비해 단단한 하이드로젤에서 더 광범위하게 퍼집니다. 실제로 부드러운 하이드로젤에 부착되는 대부분의 세포는 응축된 상태를 유지하며 부착 효율이 떨어집니다.

마우스 배아 섬유아세포에서 cycling D one mRNA 수준에 대한 대표적인 정량 PCR 결과는 cycling D one이 강성 매트릭스에서는 유의미하게 상향 조절되지만, 연성 매트릭스에서는 그렇지 않음을 보여줍니다. 이는 매트릭스 강성이 인 비트로(in vitro)에서 세포 주기 진행을 조절한다는 것을 시사합니다. 지금까지 생체 내 생리학적 조건을 모델링하여 강성이 다른 하이드로젤을 생성하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 사고나 오류가 발생할 수 있으므로 추가의 반응성 커버 슬립을 제작하는 것이 중요하다는 점을 기억하시기 바랍니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.