하여 HIV - 1 V3 루프 크라운 R2 시퀀스 Immunologically 관련 동적 차 구조 기능의 평가 순이 론적 접는

다음 실험의 전반적인 목표는 AR folding을 통해 HIV R 2 균주의 V3 crown 펩타이드 서열의 동적 구조 선호도를 평가하고, 그 결과를 R 2 균주의 알려진 중화 민감도와 상관시키는 것입니다. 이는 R 2 V3 loop crown의 적절한 단편을 선택하여 AR bonni로 folding함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 folding 시뮬레이션을 수행하여 R 2 crown 단편의 가능한 모든 컨포메이션을 탐색하고, 가장 가능성이 높은 컨포메이션들을 stack 파일에 기록합니다.

다음으로, 기록된 컨포메이션들을 분석하여 중화 민감성을 설명할 수 있는 R2V3 크라운의 동적 구조적 선호도를 결정합니다. 2차 구조 선호도 및 탐색된 컨포메이션 스택의 에너지 분포를 바탕으로, V3 루프의 12번에서 14번 위치에 있는 강직한 베타 가닥에 대한 선호도를 공유하는 결과가 도출됩니다. 안녕하세요, 뉴욕 대학교 의과대학 약리학과 실험실의 Timothy Cardozo입니다.

오늘은 GP120로 알려진 면역원성 HIV-1 바이러스 단백질의 유연한 루프(flexible loop)를 in vitro에서 단백질 접힘(protein folding)시키는 절차를 보여드리겠습니다. 이 유연한 루프는 HIV-1 바이러스의 표면 엔벨로프 당단백질의 V3 루프라고 알려져 있으며, 그 끝부분은 V3 루프의 크라운(crown)이라고 합니다. 이곳이 우리가 접힘을 유도할 영역입니다.

저희 실험실에서는 성공적인 HIV 백신 설계를 위한 생산적 경로를 식별하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 이 절차를 시작하려면, in silico로 폴딩할 V3 crown 서열을 선택하십시오.

본 연구실의 이전 연구 결과에 따르면, 모든 V3 루프 서열의 10번에서 22번 위치가 가장 좋은 결과를 나타냅니다. ICM Pro 분자 모델링 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)에 있는 사용자 친화적인 풀다운 메뉴를 사용하여 armenio 폴딩 실험을 수행하십시오. 먼저, 이 서열에 해당하는 펩타이드의 3차원 원자 구조를 컴퓨터의 가상 공간에 구축해야 합니다. 3차원 원자 구조를 구축하려면 파일 메뉴에서 '새로 만들기(new)'를 선택하십시오.

그러면 여러 개의 탭이 있는 화면이 나타납니다. 펩타이드 탭을 선택하고 텍스트 상자에 서열을 붙여넣거나 입력하십시오. 확인을 클릭하여 펩타이드의 3차원 구조를 생성합니다.

구조가 ICM 그래픽 창에 표시됩니다. 3차원 구조가 구축되면 분자 역학(molecular mechanics) 메뉴로 이동하여 최소화(minimize)를 선택하면 사이드 메뉴가 나타납니다. 해당 사이드 메뉴에서 글로벌(global)을 선택하십시오.

그러면 여러 입력 필드와 기본 매개변수로 이미 선택된 체크 박스가 있는 화면이 나타납니다. 필요한 경우, 선택 사항을 변경하여 폴딩할 펩타이드를 선택하십시오. 글로벌 이동 횟수와 로컬 최소값 호출 횟수를 각각 변경하여 시뮬레이션의 길이와 정밀도를 조정하십시오.

펩타이드의 모든 원자 폴딩(all atom folding)을 위해 'Select all'을 선택하십시오. 그런 다음 'save movie'를 선택하여 폴딩 과정의 무비 파일을 생성하십시오. 마지막으로 'apply'를 클릭하여 그래픽 창에서 폴딩을 시작하십시오.

알고리즘은 펩타이드를 다양한 구조로 접기 시작하며, 각 구조에 대한 펩타이드 에너지를 계산하고 기록합니다. 이 과정이 완료되면, 가장 에너지적으로 안정적인 펩타이드 구조와 에너지가 거의 유사한 대체 구조들이 식별되어 컴퓨터 화면에 시각화됩니다. 펩타이드 접힘을 수행합니다. GUI를 사용하면 접힘 과정이 어떻게 이루어지는지 보여주지만, V3 루프 크라운의 접힘을 위한 이상적인 파라미터 선택은 불가능합니다.

이를 위해, 스크립트를 사용하여 그래픽 인터페이스가 아닌 커맨드 라인에서 폴딩을 수행하는 것이 가장 좋습니다. 스크립트는 단순히 문서나 텍스트 파일에 한 줄씩 저장된 일련의 텍스트 명령어로, ICM 프로그램에 자동으로 입력되어 순차적으로 실행되며, 여기서는 커맨드 라인 스크립트를 통해 V3 루프를 폴딩합니다. 먼저, 컴퓨터 하드 디스크의 로컬 디렉토리에 저장될 텍스트 파일을 작성하십시오. 이전과 마찬가지로, 컴퓨터의 가상 공간에서 펩타이드를 구축하는 것부터 시작하십시오.

그런 다음 시뮬레이션의 이름을 지정하고, 접힘 과정에서 자유롭게 회전할 수 있는 펩타이드의 화학 결합인 자유 변수의 수를 설정하십시오. 다음으로, V3 루프의 최적 접힘을 위해 시뮬레이션을 실행할 시간을 지정하십시오. 이는 이전 단계에서 정의한 자유 변수의 수에 따라 달라집니다. 실험의 구조 탐색 정밀도를 결정하기 위해, 각 국소 최솟값(local minimum)에서 수행할 탐색 단계 수를 설정하십시오.

그 다음, 이전 연구를 바탕으로 시뮬레이션에 최적화된 온도 최소화, 경사도 및 확률 분포를 포함한 다른 파라미터들을 설정하십시오. 실험 파라미터 설정을 마친 후, 폴딩 과정에서 사용할 에너지 계산 방식을 지정하십시오. 여기에서는 Vander Vi 에너지를 VW internal peptide로 지정합니다.

에너지는 14로, 수소 결합 에너지는 HB electrostatic로 표시됩니다. 정전기적 에너지는 El Salvation으로 표시됩니다. 용매화 에너지는 SF로, 엔트로피는 EN으로 표기합니다. 탐색할 선호 백본 및 사이드 체인 각도와 시작 구조를 포함한 최종 설정을 지정하십시오.

마지막으로 계산을 실행하고 저장하는 명령어를 작성하십시오. 스크립트 작성이 완료되어 텍스트 파일로 저장되면, 컴퓨터 운영 체제의 명령줄 프롬프트에서 이를 실행하십시오. 이전과 마찬가지로 펩타이드의 가장 에너지적으로 안정적인 구조뿐만 아니라 에너지가 유사한 대체 구조들이 확인되며, 이는 컴퓨터에서 시각화할 수 있도록 프로젝트 파일에 저장됩니다.

계산이 완료되면 EE 드롭다운 메뉴에서 파일 열기(file open)를 선택하여 파일을 엽니다. 워크스페이스 패널에서 분자 옆의 체크박스를 클릭하여 분자를 표시하고, 분자 역학 스택 뷰(molecular mechanics stack view)를 선택하십시오. 폴딩을 통해 얻은 상위 펩타이드 컨포메이션의 에너지 순위 스택을 보려면, 스택 패널 오른쪽 하단에 있는 플로팅 도구(plotting tool)를 클릭하여 결과를 플롯하십시오.

먼저 결과 창에서 확인(okay)을 클릭한 다음, 플롯의 중간 탭인 best confo를 클릭하십시오. 이어서 결과 스택 테이블의 첫 번째 행을 클릭하십시오. 이 행은 검색에서 발견된 가장 낮은 에너지 형태(lowest energy confirmation)입니다. 그러면 그래픽 창에서 펩타이드 구조가 가장 낮은 에너지 형태로 재배열됩니다.

특히 펩타이드의 처음 다섯 개 위치에서 베타 병풍(beta strand) 유사 특성 또는 알파 나선(alpha helical) 특성이 있는지 이 구조를 분석하십시오. 서열에서 해당 영역을 선택한 다음, 화면 왼쪽 상단의 스틱 아이콘을 클릭하여 모든 원자를 표시합니다. 다음으로, 에너지 결과 스택을 분석하여 최적의 구조를 도식화해야 합니다.

최저 에너지 컨포메이션이 다른 컨포메이션들과 상당한 격차를 두고 떨어져 있다면, 이는 구조가 경직되는 경향이 있음을 나타냅니다. 결과를 평가하려면 프로젝트 바이알을 열고 molecular mechanics stack view를 선택하십시오. 그러면 스택 컨포메이션 표가 나타납니다. plot histogram 아이콘을 클릭하여 스택 컨포메이션을 시각화하십시오.

마지막으로, molecular mechanics stack play를 클릭하여 스택의 동영상을 생성하고, 여기서 폴딩을 통해 밝혀진 구조적 선호도를 시각화합니다. R two 폴딩의 결과가 표시됩니다. 구조는 alpha helical이 아니며, V three loop crowns에서 예상되는 바와 같이 random coil 형태이며, 특히 12번에서 14번 잔기 사이의 단편에서 두드러집니다.

V3 루프에서는 스택 전체에 걸쳐 명확한 베타 병풍 구조 선호도가 나타나며, 알파 헬릭스 구조는 거의 관찰되지 않습니다. 국소적인 베타 병풍 구조는 확장된 선형 모양으로 식별됩니다. 이곳은 R2 변주의 특이한 isoleucine proline methionine 서열이 위치한 곳으로, 이 위치에서 HIV 변주들 사이에 매우 드문 서열이며, R2의 특이한 특징의 원인으로 가설이 세워진 부분입니다.

또한, 최저 에너지 구조와 두 번째로 낮은 에너지 구조 사이에 거의 3단위의 에너지 갭이 관찰됩니다. 따라서, 구조가 최저 에너지 구조를 벗어나는 경우는 1% 미만이며, 이는 R2V3 크라운과 12번에서 14번 위치의 국소 베타 스트레인 구조가 완전히 유연하기보다는 더 견고한 구조를 가지고 있음을 시사합니다. 지금까지 ICM 소프트웨어에 구현된 abio 알고리즘을 사용하여 V3 루프 크라운 서열을 폴딩하는 방법과, HIV 바이러스의 R2 스트레인을 이용하여 그 결과를 분석하는 방법을 살펴보았습니다.

예를 들어, 이 절차를 수행할 때 V three crown의 단편에 해당하는 폴딩 펩타이드의 정체성을 신중하게 선택하는 것이 중요하며, 분자 모델 전문가의 자문을 통해 컨포메이션 선호도 및 에너지를 고려하여 결과를 해석하는 것 또한 중요합니다. 여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.