반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

항원 특이적 T 세포 수용체 형질전환 마우스는 체세포 핵 이식(SCN)을 통해 사전 정의된 T 세포 수용체 특이성을 가진 마우스 모델을 생성함으로써, T 세포의 발달과 기능을 연구하는 데 필수적이었습니다. 먼저 마우스에 관심 대상인 병원체를 감염시킵니다. 그 후 마우스에서 T 세포를 분리하고, 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 통해 정제합니다.

정제된 T-세포는 이후 체세포 핵 이식에 사용됩니다. 배아가 포배 단계에 도달하면 배아줄기세포를 분리합니다. 이 세포들을 포배에 주입한 후, 이를 가임기 가임 마우스(pseudo pregnant mice)로 이식합니다.

결과로 태어난 새끼들은 관심 대상인 T-세포 집단이 현저하게 증가하며, 이는 PAX 분석을 통해 검증할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 화이트 생의학 연구소(White Institute for Biomedical Research)의 박사후 연구원 Okta AK입니다. 오늘은 체세포 CLE 전이 블라스트 보조 주입법 및 배아 전이 수행 방법을 보여드리겠습니다.

체세포 전이의 주요 장점은 T세포 수용체를 내인성 유전자좌에서 발현하며, 따라서 내인성 프로모터의 조절을 받는 마우스 모델을 매우 빠르게 생성할 수 있다는 점입니다. 체세포 액상 전이는 미리 정의된 T세포 수용체 또는 B세포 수용체 특이성을 가진 마우스 모델을 생성하는 도구로 사용될 수 있습니다. 이는 자가면역, 감염성 질환 및 암과 같은 분야에서 연구하는 사람들에게 특히 유용합니다.

복강 내 주사를 통해 Toxoplasma Gandhi와 같은 병원체에 감염되어 면역 반응이 정점에 도달한 마우스로부터 병원체 특이적 T 세포를 분리하기 위해, 안락사시킨 마우스에서 비장을 적출합니다. 이후 공여 세포를 균질화하여 분리한 다음, 형광 표지 항체 및 적절한 테트라머(tetramer)와 함께 배양합니다. 마지막으로, 유세포 분석 분리(FACS)를 수행하여 병원체 특이적 T 세포를 얻습니다. 난자 탈핵 절차 전날 저녁에 수행합니다.

주사기를 사용하여 4, 5, 7 µm 크기의 피소(piso) 주입 바늘에 수은을 역방향으로 충전하여 준비합니다. 다음 날, 난자를 수집하여 체세포 핵 이식 프로토콜을 시작하고, 마우스 피펫을 사용하여 페트리 접시 내의 K-S-O-M-A-A 배지 방울로 난자를 옮깁니다. 페트리 접시의 뚜껑에서.

PVP 약 10방울, 5 µg/mL의 cyto B를 포함하는 HCZB 약 10방울, 그리고 2.5 µg/mL의 cyto B를 포함하는 HCCB 약 10방울을 떨어뜨려 체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT) 수행을 위한 플레이트를 준비합니다. 이 플레이트를 S-C-N-T-A 플레이트라고 합니다. S-C-N-T-A 플레이트를 도립 복합 현미경의 스테이지 위에 올립니다.

다음으로 7 µm 핵 제거용 니들을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고, 폐기용 PVP 용액을 5~10회 흡입하여 세척합니다. 그런저나 페트리 접시에서 중기 2기에 정지된 난자 10~30개를 5 µg/mL Cyto B가 포함된 HCCB 방울 중 하나로 옮깁니다. S-C-N-T-A 플레이트에서 실온으로 5분 동안 배양하며, 배양하는 동안 난자들을 수평으로 정렬합니다.

5분이 경과한 후, 핵 제거용 니들을 사용하여 난자를 홀딩 니들 앞에 위치시킵니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 진공을 가함으로써 난자를 마이크로 피펫 홀딩 니들에 고정합니다.

다음으로, 투명대 제거용 바늘을 사용하여 난자를 회전시켜, 난구질에 비해 매우 투명하게 보이는 염색체 방추사 복합체가 3시 방향에 오도록 맞춘 뒤, 페달을 눌러 피조 펄스(pizo pulse)를 발생시켜 투명대(zona lucida)를 관통합니다. 피조 펄스는 종방향으로 전달되어 제거 바늘의 팁을 진동시키는 기계적 펄스입니다. 이러한 팁의 진동은 투명대를 뚫고 들어가는 것을 돕습니다.

투명대(zona pellucida)를 통과한 후, 핵 제거 바늘의 입구를 중기 2기 방추사 옆에 위치시키고 진공을 가합니다. 염색체 방추사 복합체가 바늘 안으로 천천히 이동합니다. 바늘을 제거하면 세포막이 자동으로 밀폐됩니다.

마지막으로, 마우스 피펫을 사용하여 핵이 제거된 세포들을 다시 K-S-O-M-A-A 방울로 옮깁니다. 그 다음 동일한 피펫을 사용하여, 세포들을 KSOM AA 방울 사이로 차례로 옮기며 세척합니다. 핵 이식을 수행하기 위해, 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 7 µm 핵 제거 니들을 4~5 µm 핵 이식 니들로 교체합니다. 이전과 마찬가지로 PVP를 사용하여 니들을 세척합니다.

앞서 분리한 CD8 양성 T 세포를 S-C-N-D-A 플레이트 위의 PVP 한 방울에 넣습니다. 잘 혼합한 후 실온에서 최소 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 핵이 제거된 세포 10~30개를 2.5 µg/mL 농도의 HCZB 한 방울로 옮깁니다.

S ct. A 플레이트 상의 Cyto B를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 핵 이식 바늘을 사용하여 주입 바늘로 세포들을 수평으로 정렬합니다.

PVP 배지에서 공여자 CD8 양성 세포를 집어 올린 후, 외막이 분해될 때까지 흡입과 배출을 반복합니다. 필요한 경우, 피조 펄스(pizo pulse)를 가하여 막 조각과 세포질이 보이게 합니다. 핵을 바늘 안으로 끌어당깁니다.

그런 다음 핵이 10~30개가 될 때까지 계속해서 수집합니다. 다음으로, 정렬된 탈핵 난자가 포함된 액적(drop)으로 이동합니다. 진공을 가하여 홀딩 니들에 난자 하나를 고정합니다.

그런 다음 NU 핵이식 바늘을 zop lucita 옆에 배치하고, 핵이 개구부 반대 방향을 향하게 합니다. 바늘이 zop lucita를 통과할 때까지 pizo 펄스를 가합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 밀어 핵 하나를 바늘 끝으로 조심스럽게 이동시킵니다.

바늘 끝이 2/3 정도 들어갈 때까지 바늘을 난자 속으로 밀어 넣습니다. 약간의 음압을 가하여 난자 막의 일부가 바늘 안으로 들어오게 합니다. 다음 단계는 매우 중요합니다.

난자가 실제로 열려 있는 유일한 시기이므로, ZO 펄스를 한 번 가합니다. 그런 다음 양압을 가하여 바늘 밖으로 핵을 밀어냅니다.

바늘 끝이 난자의 약 3분의 1 지점에 위치하도록 조심스럽게 뒤로 당긴 다음, 음압을 가하면서 바늘을 계속해서 뒤로 당겨 난자를 밀봉합니다. 각 난자에 대해 이 단계를 반복합니다.

모든 난자에 핵이 이식되면, 난자들을 페트리 접시로 옮긴 후 37°C에서 최소 30분 동안 배양한 KS OM AA 배지의 방울 사이로 차례로 옮기며 세척합니다. 배양이 끝나면 SCN T 배아를 염화 스트론튬이 포함된 칼슘 제거 활성화 배지 방울로 옮깁니다. 염화 스트론튬은 수정 과정에서와 유사하게 칼슘 진동을 유도하여 난자를 활성화합니다.

6시간 동안 배양합니다. 원하는 경우, 히스톤 탈아세틸화 효소의 비특이적 억제제인 TSA를 활성화 배지에 첨가하십시오. 활성화 후 효율을 높이기 위해 도립 현미경으로 배아를 관찰하여 가성 전핵(pseudo pronuclei) 또는 PPN 양성 SCNT 배아의 수를 확인합니다. PPN은 그 외형으로 식별할 수 있습니다.

이들은 난자와 같은 형태를 띱니다. 세척 후 배양합니다. 배아를 K-S-O-M-A-A 배지에 떨어뜨려 37 °C에서 3.5일 동안 배양하여 배반포 단계에 도달하게 합니다.

우선, 방금 보여드린 핵 제거(nucleation) 및 핵 이식(NU nuclear transfer) 절차를 정확하게 수행하는 데 집중하십시오. 이 기술들을 숙달하면 다음 절차들을 더 쉽게 관리할 수 있습니다. 여기에 사용된 배아줄기세포(ES cells)는 표준 기술을 사용하여 유도되었습니다.

이것들은 교배 후 3.5일째인 blast assisted injection 당일에 준비해야 합니다. PVP와 HCZP가 포함된 방울을 도말하여 멸균된 박테리아 디쉬의 뚜껑을 준비하십시오. 그런 다음 이전과 동일하게 piezo pulse용 15 micrometer 주사 바늘을 준비하십시오.

다음으로, 주입 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고 PVP 전이액으로 세척합니다. HCZB 방울에 10~30회 블래스트 어시스트(blast assist)를 수행합니다. 그다음, ESL 현탁액 5~50 µL를 또 다른 HCZB 방울에 넣습니다.

ES 세포를 쉽게 채취할 수 있을 만큼 충분한 양이 있어야 하지만, 너무 밀집되어서는 안 됩니다. 다음으로, 주입 바늘을 사용하여 30~100개의 ES 세포를 채취합니다. 배반포 보조 장치가 있는 방울로 이동합니다.

블라스트 어시스트를 수평으로 맞추고 진공을 가하여 홀딩 니들로 하나를 고정합니다. 인젝션 니들을 사용하여 내세포집단이 9시 방향에 올 때까지 블라스트 어시스트를 회전시킵니다. 인젝션 니들을 3시 방향에 위치시킵니다.

바늘 끝에 ES 세포가 없는지 확인하고, 주입 바늘이 투명대와 내세포집단을 통과하여 배반포강 내로 들어갈 때까지 피조 펄스를 가합니다. 5~15개의 ES 세포가 내세포집단에 부착될 수 있도록 방출합니다. 모든 배반포에 주입이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다.

K-S-O-M-A-A로 두 번 세척한 후, 가임치 환축 마우스로의 외과적 배아 이식을 진행합니다. 마취된 가임치 환축 수용 마우스를 수술 구역에 배치합니다. 전기 면도기를 사용하여 우측 하복부의 털을 제거합니다. 해부 현미경 하에서 요오드 기반 용액과 70% ethanol을 사용하여 해당 부위를 소독합니다.

가위로 피부를 절개한 다음, 닫힌 가위를 피부와 복막 사이에 넣고 가위를 벌려 복막을 피부로부터 분리합니다. 복막을 통해 붉은 점처럼 보이는 난소를 찾습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 해당 부위의 복막을 절개합니다.

포셉을 사용하여 UCT 또는 주변 지방을 조심스럽게 잡고, 마우스 피펫에 연결된 모세관을 이용해 자궁을 끌어냅니다. 포셉으로 수란관과 자궁을 잡은 상태에서 약 10개의 배반포 그룹을 채취합니다. 바늘을 사용하여 자궁에 작은 구멍을 뚫습니다.

그런 다음 배아 이식 보조 장치가 장착된 모세관을 자궁강 내로 삽입하고 배아를 방출합니다. 자궁을 복강 내로 다시 밀어 넣습니다. 복막의 가장자리를 찾아 몇 바늘 꿰매어 닫아줍니다.

스테이플러로 마우스의 피부를 몇 군데 봉합합니다. 진통제를 피하 투여합니다. 그 후 마우스를 가열 램프가 있는 케이지로 다시 옮깁니다.

마우스가 깰 때까지 호흡 상태를 모니터링하십시오. 핵 제거 및 체세포 핵 이식 후, 배아의 약 70%에서 가성 전핵이 양성으로 나타났습니다.

이 그림에서 보는 바와 같이, 6시간 또는 10시간 동안 TSA로 처리했을 때는 아무런 효과가 없었습니다. 배양 후 3.5일이 지나자, 배아의 5~10%가 배반포로 발달했습니다.

마찬가지로, TSA의 첨가는 배반포 보조 발달률에 아무런 영향을 미치지 않았습니다. 이후 SCNT 배반포 보조물을 사용하여 배아줄기세포를 유도하였습니다. TSA는 배반포 보조물로부터 ESL이 유도되는 비율을 유의미하게 향상시켰습니다.

S-C-N-T-E-S 세포는 키메라 마우스를 생성하는 데 사용됩니다. 이 마우스들로부터 혈액을 채취하고, 여기에 나타난 것과 같이 FACS 분석을 통해 특정 T 세포의 존재 여부를 분석합니다. 혈액을 anti CDA 항체와 특정 테트라머(tetramer)로 염색하면, 이중 양성 집단을 식별할 수 있습니다.

SCNT에 사용된 공여 세포가 정확한 특이성을 가졌음을 나타냅니다. 지금까지 체세포 LU 이식, 배반포 보조 주입 및 배아 이식 수행 방법을 보여드렸습니다. 가장 중요하게 고려해야 할 점은 T세포 또는 B세포의 순도입니다.

체세포 이식 방법을 익히고 배아가 포배 단계에 도달하면, 이를 가상 임신된 암컷에 직접 이식하거나, 배아줄기세포를 유도하여 키메라 생쥐를 생성하는 방법 중 하나를 선택할 수 있습니다.