이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

안녕하세요, 저는 Baker IDI Heart and Diabetes Institute에서 박사 과정을 밟고 있는 Raja Ti입니다. 저는 신경 세포의 DNA 손상과 염색질 응축을 나타내는 Eastern modification의 3D 일러스트레이션에 포함된 단계들을 안내해 드리겠습니다. DNA는 핵 구역 주변으로 감겨 있습니다.

각 뉴클레오솜은 네 가지 서로 다른 유형의 히스톤인 H2A, H2B, H3 및 H4로 구성됩니다. DNA 절단이 형성되면 이는 H2AX의 인산화로 표시됩니다. 이러한 H2AX의 인산화는 주로 H3K4의 메틸화로 표시되는 염색질에서 일어납니다. 이제 인산화된 H2AX와 메틸화된 H3K4로 면역 표지된 세포 내 수식의 3D 일러스트레이션을 살펴보겠습니다.

시작하겠습니다. 먼저 세포 현탁액의 E 코스를 15 ml Falcon 튜브에 넣습니다. PB scentation을 이용하여 1,500 G에서 두 번 세척하고 재현탁합니다.

방사선이 세포 사건에 미치는 즉각적인 영향을 확인하기 위해 신선한 배지에 현탁합니다. 방사선 조사 전과 조사 중에 세포를 안구 위에 5분에서 10분 동안 유지합니다. 세포를 감마선 또는 X선에 노출시킵니다. 방사선 조사 후, 세포 현탁액 3 mL를 6개의 각 GU에 분주합니다.

피크 γH2AX 분석용 웰 플레이트에서 세포를 37°C로 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 비부착성 세포를 유리 슬라이드 위에 올리기 위해 사이토스핀(Cytospin) 장치를 사용합니다. 사이토스핀 클립을 조립할 때, 필터 카드가 깔때기와 완전히 일치하는지 확인하십시오.

각 사이토스핀 챔버에 50 µL의 세포 현탁액을 분주하십시오. 사이토스핀 챔버를 사이토스핀 원심분리기에 장착하고 500 RPM에서 5분 동안 원심분리하십시오. 사이토스핀 챔버를 제거하고 필터 카드에서 슬라이드를 분리하십시오. 세포가 공기 중에서 너무 오래 건조되지 않도록 주의하십시오. 이는 형광 염색의 배경색에 영향을 줄 수 있습니다.

액체 차단 핀을 사용하여 각 도말 주변에 원을 그린 후, 실온에서 4% 파라포름알데히드로 5분 동안 세포를 고정합니다. 에탄올이나 오일과 비교했을 때, 4% 파라포름알데히드에서 더 우수한 고정 효과가 관찰되었습니다. Triton X 100을 사용하여 실온에서 5분 동안 세포를 투과화한 후 슬라이드를 세척합니다.

Twin 80과 비교했을 때, Triton X 100을 사용한 세포에서 더 나은 신호를 관찰하였습니다. PP S3로 세포를 각각 5분씩 3회 관찰하십시오. 다른 블로킹 제제 및 시간과 비교했을 때, 실온에서 1% BSA로 세포를 10분 동안 블로킹하고 이를 3회 반복하십시오.

BSA는 1차 항체의 비특이적 결합을 최소화하는 데 가장 효율적이었습니다. 당사는 1% BSA가 포함된 용액으로 1:500으로 희석한 두 종류의 1차 항체를 사용하였으며, 각 슬라이드당 약 50 µL의 1차 항체를 처리하였습니다. 1차 항체를 상온에서 60분 동안 배양하는 것이 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하는 것보다 배경 염색을 줄여줍니다. PBS로 세포를 5분 동안 세 번 세척합니다.

Alexa Fluor 488은 좋은 항-마우스(anti-mouse) 항체이며, Alexa Fluor 546은 항-토끼(anti-rabbit) 항체입니다. 서로 다른 마커를 동시에 염색하기 위해 2차 항체를 사용하였습니다. 서로 다른 종에서 생성된 항체를 사용하십시오.

각 슬라이드에 희석된 2차 항체를 약 50 µL씩 추가합니다. 세포를 상온에서 90분 동안 배양합니다. 세포와 항체가 마르는 것을 방지하기 위해 습윤 챔버(moist chamber)에서 배양하는 것을 권장합니다. PBS로 슬라이드를 5분씩 3회 세척합니다.

PBS에 1:500으로 희석한 topo three 50 µL를 각 슬라이드에 첨가했습니다. PBS로 슬라이드를 5분씩 3회 세척합니다. 슬라이드의 과잉 수분을 제거하고 Antifa 용액을 첨가합니다.

Antifa 용액을 첨가하기 전에 세포를 완전히 건조시키지 않는 것이 좋습니다. 슬라이드 위에 커버 슬립을 덮습니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의해야 합니다.

슬라이드를 어둡고 습한 챔버에 하룻밤 동안 보관하십시오. 세포의 건조를 방지하기 위해 슬라이드를 매니큐어로 밀봉하십시오. 공초점 현미경으로 획득한 이미지를 통해 확인하십시오.

더 나은 공간 해상도를 얻기 위해 이미지 획득 과정에서 헬륨 레이저가 사용되었습니다. 더 높거나 낮은 배율의 렌즈보다 63배 오일 몰입 대물렌즈가 선호되었습니다. 3배 또는 4배의 줌 배율을 적용하면 더 해상도가 높은 이미지를 생성할 수 있습니다.

많은 세포로부터 FO 회계를 수행할 때는 스캔 속도를 8로, 이미지 크기를 1024 × 1024 픽셀로 설정하는 것이 바람직합니다. 다중 채널 이미징 시에는 프레임 스캔보다 순차적 라인 스캔 획득 방식이 권장됩니다. 시료의 광퇴색을 방지하기 위해, 노이즈와 신호 포화를 줄이도록 검출기 게인(gain)과 증폭기 오프셋(offset)을 조정합니다.

Kama HX X four의 크기가 0.5 µm보다 작을 수 있으므로, 최소 0.5 µm의 해상도로 이미지를 획득하는 것을 권장합니다. mark first 및 mark lost 패턴을 사용하는 제트 시리즈 패턴에서는 제트 축을 따른 스텝 크기 이미지가 필요합니다. 서로 다른 단백질 간의 공간적 관계를 나타내기 위해서는 metamor first를 사용하여 이미지 크기 2048 x 2048 픽셀, 스캔 속도 6으로 설정하는 것이 권장됩니다.

두 번째로, 다양한 공초점 현미경에서 획득한 이미지로부터 계수할 수 있습니다. 파일 메뉴에서 직접 또는 빌 번호를 사용하여 gamma hgx 이미지 태그를 엽니다. 프로세스 메뉴로 이동하여 Stack arithmetic을 선택하십시오.

최대 투영(maximum projection)을 선택하고 포함할 평면을 선택하십시오. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 이제 top hat을 선택하고 Gamma H two X 이미지를 소스 이미지로 선택한 후 적용하십시오.

Top hat 필터와 그 결과 이미지는 노이즈가 적고 초점 강도의 변동이 감소된 이진 이미지(binary image)가 됩니다. Regions로 이동하여 영역 그리기 도구를 선택하고 핵 주변에 영역을 그립니다. Process 메뉴로 이동하여 임계값 이미지(threshold image)를 생성합니다.

포함 임계값(inclusion threshold)을 선택하고 하한값과 상한값을 설정하십시오. 일반적으로 네 가지 수치에 영향을 주는 것은 임계값입니다. 최적의 임계값은 배경의 포함은 최소화하고 포자(foray)의 포함은 최대화하는 값입니다.

이는 서로 다른 임계값을 사용하여 foray 수를 계산함으로써 가장 효과적으로 달성할 수 있습니다. 그런 다음 육안으로 계산한 foray 수와 비교하십시오. DPI 이미지를 선택하고 regions 메뉴로 이동하여 transfer regions 옵션을 선택하십시오.

이제 계수를 위해 그에 상응하는 포레이(foray) 이미지와 핵 이미지가 준비되었습니다. 대부분의 핵 영역은 탑햇(top hat)으로 전송됩니다. 측정(measure) 메뉴로 이동하여 통합 영역 분석(integrated ary analysis) 또는 IMA를 선택하십시오. 모든 영역 측정(Measure all regions)을 선택하고 측정(measure)을 클릭하여 FTE 수치를 얻으십시오.

이제 Log 데이터 옵션을 사용하여 각 지역의 FTE 수치를 스프레드시트로 내보낼 수 있습니다. 이전에 생성한 각 채널별 제트 프로젝터 이미지를 엽니다. display로 이동하여 color align을 선택하십시오.

세 가지 채널 모두에 대한 이미지를 생성하기 위해 각 채널의 해당 소스 이미지를 선택하십시오. 핵 내 서로 다른 마커의 공간적 위치를 나타내기 위해 라인 스캔 분석을 수행합니다. 측정 도구 모음 명령으로 이동하여 라인 스캔 분석을 선택하고 세포를 가로지르는 선을 그리십시오.

이렇게 하면 라인을 따라 각 채널의 형광 강도를 보여주는 그래프가 생성되며, 이는 서로 다른 마커 간의 거리를 나타냅니다. 스택에서 3D 이미지를 생성하려면 스택 메뉴로 이동하여 3D reconstruction을 선택하십시오. 3D reconstruction 유형으로 maximum을 선택하십시오.

회전 평면을 선택하고, 제트 보정 거리를 선택하십시오. 일반적으로 사용자가 확인을 클릭하여 3D 재구성을 생성합니다. 이것으로 면역형광 염색 및 이미지 분석 프로토콜을 마칩니다.

요약하자면, 면역형광 공초점 현미경은 세포 핵 내의 서로 다른 C 마커와 gamma H2AX 포커스를 3차원으로 시각화하기 위한 두 가지 기술입니다. 시청해주셔서 감사합니다.