정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

이 절차의 전반적인 목적은 qPCR 기반 어레이를 신속하고 신뢰할 수 있게 자동 설정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 어레이용 프라이머 세트를 준비하고 스크리닝할 샘플 마스터 믹스를 설정합니다. 그다음, 자동화된 로봇 PCR 설정 시스템 또는 매트릭스 전자 피펫 시스템을 사용하여 384-웰 플레이트의 각 웰에 샘플 마스터 믹스와 프라이머 세트를 정확하게 분주합니다.

준비가 완료되면, 384웰 PCR 반응을 LightCycler 480 기반 PCR 프로그램으로 실행합니다. 절차의 마지막 단계는 qPCR 데이터를 분석하여 테스트한 각 프라이머 쌍에 대한 상대적 발현 수준을 결정하는 것이며, 각 프라이머 쌍은 특정 mRNA를 표적으로 합니다. 궁극적으로, 대규모 mRNA 세트의 발현 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

따라서 특별히 개발된 어레이를 통해 QPCR 기반 프로파일링으로 전체 pre-microRNA 프로파일, 특정 경로 또는 바이러스 감염의 핵심 분자들을 표적으로 삼을 수 있습니다. 안녕하세요, 노스캐롤라이나 대학교 채플힐 캠퍼스 미생물학 및 면역학과의 Dirk DMA입니다. 오늘은 실시간 qPCR 어레이를 설정하는 방법을 두 가지 방식으로 보여드리겠습니다.

하나는 수동 피펫을 사용하고, 다른 하나는 로봇을 사용합니다. 우리는 이 기술을 사용하여 인간 종양 내의 pre-microRNA와 성숙한 microRNA를 측정합니다. 오늘의 시연은 Pauline Chu와 Kristen bu가 진행하겠습니다.

그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, -20°C에 보관된 0.5 pM 농도의 186개 프라이머 쌍이 96웰 형식으로 담긴 프라이머 플레이트를 준비하십시오.

실온에서 플레이트를 해동한 후, 볼텍싱하고 짧게 원심 분리합니다. 또한 각 96웰 프라이머 플레이트 설정을 위해 사이버 그린 2배수 PCR 믹스를 실온에서 해동하며, 마스터 믹스 튜브 4개가 필요합니다. 4개의 2mL 에펜도르프 튜브에 각각 반응당 4µL의 사이버 그린 믹스, 3µL의 PCR 등급 증류수, 그리고 10~20ng의 샘플 DNA 또는 cDNA를 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다.

각 튜브에는 피펫팅 손실분을 고려하여 약 100회 반응분에 해당하는 마스터 믹스가 충분히 포함되어야 합니다. 튜브를 볼텍싱하여 혼합하십시오. 로봇 초기화 및 EVO 웨어 프로그램 로드를 통해 freedom Tecan EVO 로봇을 사용하여 전구체 micro RNA 분석 설정을 시작하십시오.

그 다음, 피펫팅 정확도에 영향을 줄 수 있는 공기 방울을 제거하기 위해 30 milliliters의 시스템 액체로 로봇을 세 번 세척합니다. 이어서 384 well plate와 96 well primer plate를 포함하도록 로봇 플랫폼을 설정합니다. 마스터 믹스 구성 요소로는 2%bleach가 담긴 트러프, 채워진 시스템 유체 용기, 그리고 빈 폐액 용기가 필요합니다.

프로그램 끝에서 run을 두 번 선택하여 자동 로봇 가동을 시작하십시오. 384-well 플레이트를 꺼내 light cycler four 80 실링 호일로 밀봉하십시오. 그 후 플레이트를 원심 분리하십시오.

밀봉된 384-웰 플레이트를 호텔의 1번 위치에 빠르게 배치합니다. 그런 다음, 새로운 마스터 믹스와 새로운 384-웰 플레이트를 사용하여 두 번째 프라이머 플레이트에 대해 이 과정을 반복합니다. 결과물인 밀봉된 384-웰 플레이트를 호텔의 2번 위치에 배치합니다.

호텔에서 라이트 사이클러로 샘플을 옮기기 위해 새로운 EVO wear 프로그램을 열고 사이클링 파라미터를 설정하십시오. 그런 다음 run을 두 번 선택하십시오. Freedom Evo가 자동으로 각 플레이트를 라이트 사이클러에 로드하고 cyber green HRM 사이클링 프로그램을 실행합니다.

완료되면, 로봇을 사용하는 대신 서면 프로토콜에 설명된 대로 결과를 검토하고 분석하십시오. 매트릭스 전자 다채널 피펫을 사용하여 마스터 믹스 튜브 1의 내용물을 리저버에 옮길 수 있습니다.

전자 피펫을 설정하여 마스터 믹스 16 µL를 흡입한 후, 8 µL씩 두 번 분주하고 이어서 퍼지 단계를 수행하도록 설정합니다. 피펫 설정 후 마스터 믹스 16 µL를 흡입하고 384 휠 플레이트에 분주하기 시작합니다. 1열의 A행부터 O행까지 한 행 건너 하나씩 첫 번째 8 µL를 분주하며, 다음 열은 비워둡니다.

두 번째 8 µL를 3열의 동일한 행에 분주합니다. 그런 다음 폐기물 컨테이너 위에서 팁을 비우고, 한 행과 한 열씩 건너뛰는 이 패턴에 따라 팁을 제거합니다. 마스터 믹스 2를 피펫팅하기 위해 플레이트 전체에 걸쳐 이 과정을 5회 더 반복합니다.

마스터 믹스 1과 동일한 행을 사용하되, 2열부터 시작하십시오. 마스터 믹스 3과 4에 대해서도 이 절차를 반복하며, 각각 1열과 2열부터 시작하되 이번에는 프라이머 플레이트의 B행부터 P행까지를 사용하십시오. 전자 피펫을 2 µL 흡입하고 2 µL 분주하도록 설정한 후, 퍼지(purge) 단계를 수행하십시오.

96-웰 프라이머 플레이트의 1열 A행부터 H행까지의 프라이머 2 µL를 384-웰 플레이트 1열의 한 행 건너 하나씩 옮기고, 폐기물 용기 위에서 퍼지한 후 팁을 폐기합니다. 1열과 2열의 나머지 마스터 믹스 3종에 대해 쿼트(quatt) 프라이머로 이 패턴을 반복합니다. 그런 다음 96-웰 프라이머 플레이트의 2열부터 12열까지 이 과정을 계속하며, 각 프라이머 열마다 384-웰 플레이트에서 두 열씩 건너뛰며 이동합니다.

다음으로, 플레이트를 라이트 사이클러 덮개와 호일로 밀봉하고 원심분리합니다. 원심분리 직후, 플레이트를 light cycler 480에 넣고 SYBR Green I HRM 검출 포맷을 사용하여 사이클을 가동합니다.

이전과 동일한 사이클링 조건을 사용하여, 새로 준비된 마스터 믹스를 이용해 프라이머 플레이트 2 Eloqua를 새로운 384-웰 플레이트에 넣고 이 절차를 반복합니다. 새로운 QPCR 기반 어레이를 이용한 프로파일링을 통해 전구체 micro RNA 시그니처가 나타납니다. U6로 정규화된 평균 델타 CT를 계산하고 표준화된 값을 어레이에 입력하였습니다.

히트맵으로 표시된 세 개의 서로 다른 클러스터를 생성한 Minor 소프트웨어 결과입니다. 각 전구체 micro RNA의 상대적 발현량이 표시되어 있으며, 빨간색과 파란색은 각각 상대적 발현의 증가와 감소를 나타냅니다. 색상의 강도는 발현 변화의 정도를 나타냅니다.

대부분의 전구체 microRNA는 예상대로 미미한 변화를 보였습니다. 하지만 일부 전구체 microRNA는 전체 시간 경과 실험 동안 유의하게 증가했습니다. 또한, 일부 전구체 microRNA의 상대적 수준은 급격히 감소했습니다.

일부 사례에서는 히트맵 분석 시 이들이 함께 클러스터를 형성하기도 합니다. 실험에 따라 바이러스 감염, 세포 유형 특이적 전구체 microRNA 발현, 또는 공통 분자나 신호 전달 경로에 의해 조절되는 전구체 microRNA에 의존적인 클러스터가 나타날 수 있습니다.

4회 반복 측정된 Kaposi sarcoma associated herpes virus 음성 샘플의 평균 cycle threshold(Ct) 값이 표시되어 있습니다. 중요한 점은, 매우 민감한 QPCR 어레이를 통해 분석했을 때 이 샘플에서 Kaposi's sarcoma associated herpes virus latency associated nuclear antigen 또는 KSHV Lana가 검출되지 않았다는 것입니다. 하지만 내부 대조군인 U six와 고발현 인간 전구체 micro RNA인 let seven a는 모두 검출 가능한 수준으로 발현되었습니다.

마지막으로, 예상대로 PCR 등급의 멸균수를 사용한 음성 대조군에서는 A-Q-P-C-R 산물이 생성되지 않았습니다. 동일한 샘플 중복 시료를 사용하여 두 가지 서로 다른 프라이머로 분석한 용융 곡선 분석 결과가 제시되어 있습니다.

두 프라이머 쌍의 용융 온도가 서로 다르다는 점은 분명하지만, 각 반복 실험에서 시료는 정확히 동일한 온도에서 용융되고 있습니다. 불량하거나 오염되었을 가능성이 있는 시료의 징후로는 두 가지 서로 다른 입력원의 존재를 시사하는 여러 개의 용융 피크가 나타나는 경우가 포함될 수 있습니다. 지금까지 로봇을 사용하여 실시간 QPCR 실험을 설정하는 방법을 보여드렸습니다.

모든 대조군과 가능한 한 많은 housekeeping gene을 포함하는 것이 중요합니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.