사용자 정의 MicroRNA의 Microarray 실험을 수행

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로 RNA 마이크로어레이 실험을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 마이크로 RNA 프로브 라이브러리가 포함된 프린트된 마이크로어레이 슬라이드를 확보하고, 적절한 품질과 양의 RNA 샘플을 준비함으로써 이루어집니다. 그 다음, RNA와 대조군 DNA 샘플을 형광 염료로 표지합니다.

그 다음, 표지된 핵산을 하이브리드화를 위해 마이크로어레이 슬라이드에 첨가합니다. 마지막으로, 마이크로어레이 슬라이드를 세척 및 스캔하고 슬라이드를 재생합니다. 결과적으로, 개별 microRNA 프로브의 하이브리드화 강도에 대한 슬라이드 분석을 통해 microRNA의 전장 게놈 발현을 나타내는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 정상적인 생리학적 조건 또는 병리학적 조건이 전역적 규모에서 마이크로어레이 발현에 어떻게 차별적인 영향을 미치는지와 같이 유전자 발현 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마이크로어레이 제작의 품질은 마이크로어레이 실험의 성공을 결정짓는 가장 중요한 요소 중 하나입니다. 소형 RNA를 보존하는 방법으로 RNA를 분리하고 2 mg/mL 이상의 농도로 재현탁한 후, 약 25 µg의 총 RNA를 T4 RNA Ligase 1, DTT 및 ATP가 보충된 1X HEPs 버퍼 내의 0.5 µg 5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3'와 먼저 혼합하여 20 µL 반응 부피에서 RNA를 표지합니다. 사용 가능한 RNA 양이 더 적은 경우, RNA 양과 반응 규모를 줄이십시오.

RNA가 매우 희석된 경우, 침전물을 돕기 위해 yeast tRNA와 같은 캐리어를 추가하고, 냉장고 내 얼음 위에서 2~24시간 동안 반응물을 배양하십시오. 다음으로, sodium acetate를 0.3 molar가 되도록 첨가한 후, ethanol을 3배 부피로 넣고 -20 °C에서 하룻밤 동안 RNA를 침전시킵니다. 슬라이드를 처음 사용하는 경우, 3 XSSC, 0.1% SDS, 0.2% BSA가 포함된 여과 용액에서 37 °C로 30~60분 동안 사전 하이브리드화하십시오.

다음으로, 슬라이드를 물에 몇 차례 담갔다 뺍니다. 그 후 이소프로판올에 담갔다가, 슬라이드 어댑터가 장착된 원심분리기를 사용하여 22 °C에서 100 ×g로 5분 동안 슬라이드를 건조합니다. 리프터 스트립을 물로 헹굽니다.

그 후 공기 중에서 건조하기 전 에탄올 상태에서, 마이크로어레이 하이브리드화 챔버 베이스 내부에 슬라이드를 놓고 슬라이드 위에 리프터 슬립을 올려 리프터 슬립이 프로브 영역과 흰색 스트립을 덮도록 합니다. 어두운 곳에서 슬라이드를 접촉시키고, 침전된 표지 RNA를 원심 분리하여 가라앉힌 후 70% ethanol로 한 번 세척하고 펠릿을 공기 중에서 건조합니다. 펠릿은 붉은색을 띠어야 합니다.

RNA 샘플당 정제된 표지 참조 DNA를 부피 대비 1/15에서 1/100 비율로 사용하여 하이브리드화 용액을 준비합니다. 하이브리드화 용액이 마르지 않도록 약 60 microliters의 하이브리드화 용액으로 RNA 펠릿을 완전히 용해합니다. 배양하는 동안 마이크로어레이 하이브리드화 챔버 베이스의 각 가습웰에 20 microliters의 물을 추가합니다.

표지된 RNA와 참조 DNA 혼합물을 슬라이드에 추가합니다. 얇은 피펫 팁을 사용하여 리프터 슬립의 가장자리를 가볍게 터치하고 흡입합니다. 용액이 리프터 슬립과 슬라이드 사이의 공간으로 들어가게 합니다.

하이브리드화 챔버 커버를 베이스 위에 덮습니다. 그다음 금속 클립으로 챔버를 밀봉합니다. 챔버 카세트와 함께 제공된 플라스틱 백 안에 챔버 전체를 넣습니다.

마지막으로, 챔버 카세트를 젖은 페이퍼 타월이 들어 있는 용기에 넣습니다. 그런 다음 용기를 플라스틱 랩으로 덮고 37 °C의 습윤 세포 배양 인큐베이터에 약 24시간 동안 보관합니다. 하이브리드화 후 슬라이드를 처리하려면, 챔버 카세트를 하나씩 분해하여 슬라이드와 리프터 슬립을 22 °C의 2X SSC에 담급니다.

리프터 슬립은 슬라이드에서 자연스럽게 떨어집니다. 슬라이드를 0.8 XSSC로 2회, 이어서 0.4 XSSC로 3회, 총 1~2분 동안 세척하십시오. 슬라이드 어댑터가 장착된 원심분리기를 사용하여 슬라이드를 건조합니다. 다음으로, 마이크로어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔하고 BlueFuse와 같은 프로그램을 사용하여 이미지 파일의 강도를 정량화하십시오.

개별 스팟을 검사하여 하이브리드화 이후 포어 슬라이드 프린팅이나 슬라이드 취급 과정에서 주로 발생하는 비정상적인 스팟을 제외하십시오. 데이터 분석 및 제시를 위해 gene springing 및 excel과 같은 프로그램을 사용하여 마이크로어레이를 재사용하십시오. 슬라이드를 물로 헹군 다음, 62 °C로 예열된 1 mM NaOH 및 0.1 X SSC 염색 접시에 10~20분 동안 담가 슬라이드를 스트립하십시오.

인큐베이션을 두 번째로 반복합니다. 22 °C에서 부드럽게 흔들어주며 최대 60분 동안 물로 슬라이드를 여러 번 세척합니다. 원심분리기를 사용하여 슬라이드를 건조시킨 후 22 °C에서 보관합니다.

슬라이드는 사전 하이브리드화 없이 사용할 수 있습니다. 이 그림은 매우 정밀하고 강한 하이브리드화 신호를 보여주는 마이크로어레이의 스캔 이미지입니다. 빨간색 점은 참조 DNA의 하이브리드화 결과이며, 초록색 점은 DY 5 47로 표지된 RNA 샘플의 결과이고, 노란색 점은 DNA와 RNA 모두 동일한 프로브에 하이브리드화되어 나타난 결과입니다.

마이크로어레이 하이브리다이제이션 기술적 반복 시료 간의 피어슨 상관계수는 약 0.99로, 이는 매우 우수한 재현성을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 micronase뿐만 아니라 mRNA와 같은 다른 유형의 핵산을 정량화하기 위한 맞춤형 마이크로어레이 실험 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.