접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

이 절차의 전반적인 목표는 신선 농산물의 접착 테이프 기반 샘플링을 rapid fluorescence in situ hybridization(FISH로 알려진 신속 형광 인시튜 하이브리다이제이션)을 이용한 salmonella 종의 전세포 분자 검출법과 결합하는 것입니다. 이는 먼저 원하는 재료에 접착 테이프를 부착하여 표면에 결합된 세포를 추출함으로써 수행됩니다. 세포가 포집된 테이프는 직접 분석하거나 고상 또는 액상 농축 과정을 거칠 수 있습니다.

절차의 두 번째 단계는 배지 내에 들어있거나 배지에서 농축된 세포를 대상으로 테이프 상에서 자체 고정 및 에탄올 시리즈를 이용한 탈수를 진행하는 것입니다. 두 번째 단계에는 부유 상태에서의 세포 고정이 포함되며, 이후 보관 버퍼로 세포를 재부유시킵니다. 절차의 세 번째 단계는 살모넬라 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브 칵테일을 사용하여 테이프 상에서 신속한 하이브리드화 단계를 수행하는 것이며, 이어서 세척 버퍼 린스로 과잉 프로브를 제거합니다. FAX를 통해 분석하는 샘플의 경우, FISH 단계는 부유 상태에서 수행되며, 분석 전 간단한 희석 단계를 통해 과잉 프로브를 제거할 수 있습니다.

절차의 마지막 단계는 하이브리드화된 테이프 결합 세포를 DPI로 대조 염색하고 형광 현미경을 사용하여 관찰하는 것입니다. 사실 기반 분석의 경우, 대조 염색은 필요하지 않습니다. 궁극적으로, 이 방법은 샘플링된 신선 농산물에 존재할 수 있는 살모넬라 종을 시각적 또는 세포 분석적으로 검출하는 수단을 제공합니다.

저는 로마 시대의 에어로 스톤(aero stone) 유물에 있는 박테리아 군집을 조사하기 위해 유사한 접근 방식을 사용한 이탈리아 연구팀에 관한 글을 읽으면서 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 그 후 저와 r은 제가 강의하던 식품 미생물학의 신속 분석법 수업에서 이 연구에 대해 토론을 진행했습니다. 몇 주 후, 신선 농산물에서 기인한 살모넬라(salmonella) 식중독 사고가 발생하여 결국 43개 주에서 약 1500명의 환자가 발생했습니다.

본 실험적 접근 방식은 신선 농산물에서 특정 박테리아 유형을 검출하기 위한 시의적절하고 실용적인 방안을 제공할 뿐만 아니라, 현장이나 식품 생산 환경에서 테스트가 가능할 정도로 휴대성이 뛰어납니다. 먼저 샘플링에 사용할 테이프를 선택하십시오. 시중에서 판매되는 곰팡이용 테이프나 멸균 처리되어 사용이 간편하게 포장된 접촉 플레이트 등이 선택지에 포함됩니다.

멸균된 알루미늄 템플릿을 사용하여 10 cm 길이의 접착 테이프의 비접착면에 1 cm 크기의 정사각형을 유성 마커로 그립니다. 이는 테이프의 어느 부분이 식품 또는 환경 표면 샘플링에 사용되었는지 표시하는 시각적 가이드 역할을 합니다. 접착면이 샘플링할 표면을 향하도록 테이프로 C자 모양의 루프를 만듭니다. 이를 위해 엄지와 중지로 접착 끝부분을 잡고, 검지 손가락을 테이프 뒷면에 그려진 정사각형에 댑니다.

샘플링할 표면에 테이프를 놓은 다음, 테이프의 가장자리를 떼지 않은 상태로 표시된 영역을 표면에 부드럽게 누릅니다. 검지 손가락을 사용하여 테이프의 점착면이 샘플 표면에 완전히 밀착되도록 합니다. 이때 고른 동작으로 눌러 기포가 생기지 않도록 합니다.

샘플에서 테이프를 천천히 떼어냅니다. 표면에 결합된 미생물을 물리적으로 추출하여 세포 전하를 고정합니다. 일반 투명 사무용 테이프의 접착면이 위로 향하게 하여 유리 현미경 슬라이드 위에 붙이되, 테이프를 적절히 당겨 팽팽하게 유지함으로써 주름 없이 평평한 표면이 형성되도록 합니다.

이는 이후 가열 과정에서 테이프의 변형이나 말림 현상으로 인한 문제를 최소화하는 데 도움이 됩니다. 하이브리드화 단계에서는 샘플링된 세포가 agri 표면과 직접 접촉하여 나중에 agri 표면에서 테이프를 쉽게 제거할 수 있도록, 테이프의 면이 아래를 향하게 하여 xylose slicing tertile four 또는 XLT four agri 플레이트에 놓으십시오.

증식 후, 테이프의 템플릿 샘플 접촉 부위를 agri 표면에 밀착시키고 테이프의 한쪽 끝을 느슨하게 부착합니다. 응결을 방지하기 위해 페트리 접시의 측벽이 위로 가도록 뒤집어 35 °C에서 배양합니다. 살모넬라 종이 충분히 성장하도록 하기 위해, 세포를 검출 가능한 수준까지 증식시키는 데 필요한 배양 기간은 초기 살모넬라 오염 수준에 따라 달라집니다.

원하는 농축 기간이 지난 후, 배양 중에도 접착력이 유지되는 테이프가 부착된 한천 배지 플레이트를 엽니다. 테이프와 한천의 접촉면에 형성된 미세 군집을 최대한으로 회수할 수 있도록 검지 손가락을 사용하여 테이프를 한천 쪽으로 가볍게 누릅니다. 페트리 접시 벽면에 부착된 테이프 가장자리를 잡고 천천히 일정한 동작으로 제거합니다. 일반 투명 사무용 테이프를 사용하여, 표면이 평평하고 주름지지 않도록 세포 전하 테이프의 접착면이 위로 향하게 하여 현미경 슬라이드 위에 고정합니다.

샘플 접촉 부위를 500 µL의 10% 중성 완충 포르말린으로 덮어 25 °C에서 30분 동안 테이프 세포 고정을 수행합니다. 자극성 또는 독성 증기 노출을 최소화하기 위해 화학 흄후드 내 밀폐 용기에 고정액을 버리고, 테이프 표면에 1x 인산 완충 식염수(PBS)를 부드럽게 흘려주어 테이프를 한 번 세척하여 샘플을 탈수합니다. 단계적 에탄올 시리즈를 사용하여 상용 분자생물학 등급 용액으로 사전 하이브리드화, 하이브리드화 및 세척 완충액을 준비하고, 0.22 µm 시린지 필터로 여과한 후 하이브리드화 및 세척 완충액을 55 °C로 예열합니다.

최종 프로브 농도가 5 ng/µL가 되도록 예열된 하이브리다이제이션 버퍼에 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 추가합니다. 프로브 칵테일이 포함된 하이브리다이제이션 버퍼 300 µL를 테이프의 템플릿 샘플 접촉 부위에 덮습니다. 하이브리다이제이션된 테이프 결합 세포를 슬라이드 모드 기기와 같은 직접 접촉식 인큐베이터의 55 °C로 설정된 습윤 밀폐 배양 챔버에서 15분 동안 하이브리다이제이션 시킵니다. 하이브리다이제이션 후 슬라이드를 꺼내고 프로브가 포함된 하이브리다이제이션 버퍼 오버레이를 제거합니다. 피펫팅을 통해 예열된 세척 버퍼로 짧고 부드럽게 헹굽니다.

기울인 슬라이드 위에 소량의 완충액을 처리하여 슬라이드를 자연 건조시키면 형광 현미경을 통한 salmonella 종의 onap 검출이 가능해집니다. 핵 대조 염색제인 dpi가 포함된 마운팅 용액인 vector shield H 1200을 슬라이드 위에 약 10 µL 도포하고 암소에서 10분 동안 배양합니다. 커버 슬립 위에 침강유를 떨어뜨린 후 고배율 오일 렌즈를 사용하여 시료를 관찰합니다.

DPI 필터는 시료의 초점을 맞추는 데 사용됩니다. 그런 다음 현미경을 적절한 필터로 전환하고, 프로브 표지에 사용된 염료에 따라 salmonella 세포의 녹색 또는 적색 형광을 시각적으로 판독합니다. 유세포 분석법 검출을 위해서는 PBS에 현탁된 시료를 5 mL 라운드 바텀 샘플링 튜브로 옮기고, 647 nm에서 여기(excitation)를 통해 유세포 분석기로 분석합니다.

FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 인위적으로 오염시킨 토마토 표면에서 Ty Murium terica serovar를 점착 테이프로 샘플링하면, 현미경 관찰이나 유세포 분석 세포 충전을 통해 사후 분석을 직접적으로 수행할 수 있습니다. 테이프는 salmonella 특이적 DNA 프로브 조합을 이용한 신속 형광 C two 하이브리드화 공정을 거쳤으며, 테이프 상의 salmonella 세포 초기 국소 농도에 따라 Texas Red로 표지되었습니다.

고체상 농축 결과, 단일 마이크로 콜로니부터 합쳐진 형태로 자란 군집까지 다양하게 나타났습니다. 테이프로 채취한 세포는 샘플링 직후 또는 5시간의 액체 표면 배양 후에 FISH 및 유세포 분석법의 결합을 통해 분석할 수 있었습니다. 35 °C에서 미니 배양 농축을 수행하였습니다.

우리는 식품 안전을 위한 테이프 피쉬 기법의 사용법을 설명하였으나, 이 방법은 환경 미생물학, 식물 병리학 또는 임상 미생물학을 포함한 다른 분야에서도 활용될 가능성이 높습니다. 이 절차와 병행하여, 테이프로 추출한 시료의 고상 또는 액상 증균 배양액에 대해 생화학적 테스트나 PCR과 같은 추가 실험을 수행할 수 있습니다. 이러한 테스트는 피쉬 절차의 범위를 벗어나, 존재할 수 있는 salmonella에 관한 질문들에 답하는 데 사용될 수 있습니다.