전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

다음 실험의 전반적인 목표는 전기화학 센서를 사용하여 박테리아를 검출하고 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 박테리아에서 리보솜 RNA를 방출시켜 불소화 검출 프로브와 하이브리드화되도록 하며, 두 번째 단계로 검출 프로브와 결합된 리보솜 RNA를 작업 전극에 첨가하여 센서 표면의 캡처 프로브와 하이브리드화되도록 합니다. 그다음, 안티 플루오레세인 서양고추냉이 과산화효소 접합체가 불소화 검출 프로브에 결합되도록 합니다.

마지막으로, 센서 표면의 캡처 프로브 리보솜 RNA 검출 프로브 복합체 수와 상관관계가 있는 간섭계 전류의 강도를 얻을 수 있습니다. 배양 기반 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 박테리아가 EDGAR 플레이트에서 가시적인 콜로니를 형성하기까지 하룻밤을 기다릴 필요 없이 약 45분 만에 박테리아를 검출하고 식별할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 적용은 감염성 질환의 관리를 개선할 것입니다.

박테리아 병원균의 조기 발견은 표적 항생제 치료와 임상 결과 개선에 필수적입니다. 이 방법은 감염성 질환의 진단에 유용하며, 면역 진단과 같은 다른 진단 문제에도 적용될 수 있습니다. 먼저, 캡처 프로브의 티올기가 환원되어 결과의 일관성을 높일 수 있도록, 희석된 캡처 프로브를 헥산 디티올(hexane di thiol)과 함께 실온에서 10분 동안 배양하십시오.

배양 후, 질소 기류를 금 16 센서 어레이 칩에 5초 동안 분사하여 수분이나 미립자를 제거합니다. 센서 어레이의 작업 전극에는 소량의 액체를 주의해서 도포해야 합니다. 이 기술의 시각적 시연이 매우 중요합니다.

피펫팅과 세척 및 건조 기술을 적절하게 수행하면 칩 간의 변동성을 크게 줄일 수 있습니다. 다음으로, HDT 희석 캡처 프로브 혼합물 6 µL를 센서 어레이의 16개 센서 모두의 작업 전극에 도포하고, 센서 칩을 덮개가 있는 페트리 접시에 넣어 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날, 센서 칩을 탈이온수로 2~3초 동안 세척한 후 질소 기류 하에서 5초 동안 칩을 건조합니다. 이제 attri hydrochloride sodium chloride, EDTA MERCAPTOETHANOL 용액 6 µL를 16개 센서 모두의 작업 전극에 도포하고, 센서를 페트리 접시에 넣어 상온에서 50분 동안 배양합니다.

전기화학 센서 분석을 위한 시료를 준비합니다. 대수 성장기의 박테리아 배양액 1 mL를 미세 원심분리 튜브에 옮긴 후, 16,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 병원성 박테리아는 반드시 생물안전 작업대(biosafety hood) 내에서 취급해야 함에 유의하십시오.

snat를 제거한 후, 1 M 수산화나트륨 10 µL가 담긴 피펫 팁을 마이크로 원심분리 튜브 바닥에 대고 여러 번 피펫팅하여 펠릿을 완전히 재현탁합니다. 현탁액을 실온에서 5분 동안 배양한 후, 박테리아 용해물을 중화시키기 위해 소 혈청 알부민(BSA)과 플루오레세인 변형 검출 프로브가 포함된 PBS 50 µL를 첨가합니다. 그다음 중화된 용해물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.

준비된 센서 칩 중 하나의 머캅토에탄올 용액을 탈이온수로 2~3초 동안 세척하여 이 단계를 시작합니다. 방금 시연한 방식대로 칩을 건조시킨 후, 중화된 박테리아 용해물을 작업 전극에 4 µL 도포합니다. 센서 14개.

그 다음, PBS 및 BSA, 플루오레세인 변형 검출 프로브가 포함된 가교 올리고뉴클레오타이드 4 µL를 두 개의 양성 대조군 센서에 처리합니다. 용해물과 양성 대조군 센서를 15분 동안 배양한 후, 이전과 동일하게 센서 칩 전체를 세척하고 건조합니다. 이제 카제인이 포함된 PBS 내의 항-플루오레세인 서양고추냉이 퍼옥시다아제(anti fluorescein horse radish peroxidase 또는 HRP) 4 µL를 16개 센서 모두의 작업 전극에 처리합니다.

15분간 배양한 후, 센서 칩을 세척하고 건조합니다. 다음으로, 센서 칩 표면에 필름 웰 스티커를 부착하고 칩을 센서 칩 마운트에 장착한 뒤, 16개의 모든 센서에 TMB 기질 50 µL를 분주하고 센서 칩 마운트를 닫습니다. 마지막으로, Helios 칩 리더기를 사용하여 16개 모든 센서의 파이로메트리 및 사이클릭 텔레메트리 측정값을 얻습니다.

방금 설명한 전기화학 분석법은 이 그림에 표시된 것과 같이 샌드위치 ELISA와 유사한 구조로 이루어져 있습니다. 표적 ribosomal RNA와 포획 및 검출 프로브 간의 하이브리드화는 검출 프로브의 3-prime fluorescein 결합 부위에 결합하는 anti-fluorescein 항체 단편에 접합된 HRP에 의해 촉매되는 산화 환원 반응을 통해 검출됩니다. 분석 감도의 중요한 구성 요소는 금 전극의 표면 화학입니다. 금 전극은 mercaptoethanol과 hinol로 코팅되며, 희석된 포획 프로브를 추가하여 기능화합니다.

표적 리보솜 RNA가 캡처 프로브 및 플루오레세인 표지 검출 프로브와 샌드위치 하이브리드화를 형성하면 복합체가 생성되며, 이는 항-플루오레세인 서양고추냉이 퍼옥시다아제 접합체와 TMB 기질의 첨가에 의해 검출됩니다. M 파라메트릭 전류는 서양고추냉이 퍼옥시다아제에 의한 TMB의 산화와 전극으로부터 오는 전자에 의한 TMB의 환원으로 인해 발생하는 산화환원 주기에서 생성됩니다. 본 실험에서 사용된 분석에는 gene fluidic 16 센서 어레이 칩이 사용되었습니다.

어레이의 각 센서에는 작업 전극, 기준 전극 및 보조 전극의 세 가지 전극이 포함되어 있으며, 이들은 칩의 가장자리에 접점 부위를 가지고 있습니다. 칩 리더에는 각 접점과 연결되는 포고 핀(pogo pin)이 장착되어 있습니다. 칩 리더는 컴퓨터 알고리즘으로 제어되는 전위 가변기(potentiometer)와 센서 어레이 사이의 인터페이스 역할을 합니다.

여기 전기화학 센서의 전류 흐름 예시가 제시되어 있습니다. 파라미터 측정이 시작된 후 처음 몇 초 동안 센서의 전류 흐름은 인위적으로 높게 나타납니다. TMB를 센서 표면에 도포한 시점부터 리더 알고리즘이 시작될 때까지 산화된 기질이 축적되기 때문에, 이후 전류 흐름은 빠르게 정상 상태에 도달하며 60초 이내에 정확한 센서 판독값을 안정적으로 얻을 수 있습니다.

센서 간 변동성은 비교적 일정하므로, gene fluidic 16 센서 어레이 칩에서 16가지의 서로 다른 센서 분석을 병렬로 수행할 수 있습니다. 양성 및 음성 대조군은 필수적이며, 양성 대조군으로는 캡처 프로브와 검출 프로브 모두에 하이브리드화되어 알려진 농도의 합성 타겟 역할을 하는 합성 브릿징 DNA 올리고뉴클레오타이드가 사용됩니다. 이렇게 브릿징 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 얻은 결과는 칩 간 변동성을 최소화하기 위한 내부 교정 대조군으로 기능합니다.

전극의 음전류가 클수록 신호가 더 높게 나타납니다. 캡처 및 검출 프로브를 테스트할 때, 이 그림에 표시된 것과 같이 기지 농도의 샘플을 연속 희석하여 검출 한계를 결정해야 하며, 분석의 동적 범위 내에서 샘플 농도와 출력 신호 사이에 선형 로그-로그 상관관계가 존재합니다.

이 막대 그래프에서는 요로 감염 환자의 소변에서 자주 발견되는 Escherichia coli, Klebsiella spp. 및 암모니아를 포함하는 시료의 대표적인 결과가 나타나 있습니다. 대부분의 센서 신호는 낮고 유사하게 나타나며, 이러한 음성 결과는 배경 신호 반응성으로 통합될 수 있습니다. KE 프로브 쌍은 Escherichia coli와 이를 구분합니다. 브릿징 올리고뉴클레오타이드는 양성 대조군 및 내부 보정 표준물질로 사용됩니다. 이 기술은 항생제에 대한 박테리아의 표현형 반응을 측정함으로써 임상 검체 내 항생제 내성 박테리아 검출에 적용될 수 있습니다.

이 기술은 개별 환자에게 최적의 치료법을 결정하는 데 활용될 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 칩 내의 서로 다른 종 특이적 센서에서의 전류를 비교하여 박테리아를 검출하고 식별하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.