Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

본 절차의 전반적인 목표는 포유류 세포에서 mRNA의 핵 수출(nuclear export) 역학을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 포유류 조직 배양 세포의 핵 내로 mRNA 또는 DNA를 미세 주입함으로써 수행됩니다. 미세 주입 후, 다양한 배양 시간 경과 후에 시료를 고정합니다.

그 다음 mRNA를 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization) 또는 FISH로 염색합니다. 절차의 마지막 단계는 세포를 이미징하고 세포질과 핵 내의 형광량을 정량화하는 것입니다. 결과적으로, 미세주입법과 형광 현미경법의 조합을 통해 mRNA 수출 속도를 측정할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 토론토 대학교 생화학과의 Alex Palazzo 연구실 소속 SRG AV입니다. 저는 Palazzo 연구실의 Stefan Toski입니다. 저는 Palazzo 연구실의 Amy이며, 저는 Palazzo 연구실의 Khi Maha David입니다.

오늘은 미세주입법을 통해 포유류 조직 배양 세포의 핵 내로 mRNA를 도입하는 절차를 보여드리겠습니다. 또한 형광 인 시투 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization)을 이용하여 mRNA를 염색하는 방법도 시연하겠습니다. 저희 실험실에서는 포유류 세포 내 mRNA의 핵 수출 역학을 연구하기 위해 이러한 절차를 사용합니다.

그럼 시작해 보겠습니다. 미세주입 전, 미리 준비한 플라스미드 DNA를 주입 완충액에 50에서 200 µg/mL 농도로 조절합니다. 다음으로, 주입된 세포를 식별할 수 있도록 Oregon Green 488 또는 OG가 접합된 70 kDa dextran을 혼합물에 추가합니다.

OG 결합 덱스트란(OG conjugated dextran)을 통해 액체가 핵으로 얼마나 주입되었으며, 세포질로 얼마나 누출되었는지 결정할 수 있습니다. 바늘 끝을 잠재적으로 막을 수 있는 입자성 물질을 펠렛(pellet)화하기 위해 시료를 13,000 G, 4°C에서 최소 20분 동안 원심 분리합니다. 서면 프로토콜 비용에 기술된 기준에 따라 미세 주입할 포유류 세포주를 선택하십시오.

본 시연 시드에서는 7개의 세포를 사용합니다. 마이크로인젝션 최소 24시간 전에 30 millimeter 페트리 접시 내의 산 세척된 커버슬립 위에 세포를 배양합니다. 주입된 세포를 쉽게 식별할 수 있도록 주입 시점에 세포 단층의 합쳐짐(confluency) 정도가 약 70에서 90%인 것이 이상적이며, 주입 전 200 microliter 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 세포 단층에 상처를 냅니다.

커버슬립에 십자형 상처를 낸 후, 주입 전 최소 15분 동안 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 회복시키십시오. 미세주입을 위해, 미세주입 과정에 방해가 될 수 있는 진동을 최소화하도록 에어 테이블 위에 설치된 도립현미경을 사용하십시오. 펠렛이 손상되는 것을 방지하기 위해, einor 젤 로더 팁을 사용하여 원심분리 시료의 상단에서 약 1 µL를 제거하십시오.

피펫 팁을 기제작된 미세주입 바늘의 뒷부분에 삽입하고 액체를 분사합니다. 모세관 현상에 의해 액체가 바늘 팁 내부로 빨려 들어갑니다. 5~30초 이내에 팁 근처에 메니스커스가 보여야 합니다.

액체가 채워진 바늘을 완드에 넣고 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다. 10배 대물렌즈를 사용하여 45도 각도로 바늘을 관찰하고, 초점 평면 근처의 시야 중심에 위치시킵니다. 거친 조절 마이크로 매니퓰레이터 노브를 사용합니다. 완드는 튜브를 통해 유리 시린지와 연결되어 있으며, 이 시린지를 사용하여 바늘 끝에서 액체를 분사하는 데 필요한 압력을 생성합니다.

일정한 압력을 유지하기 위해 시린지를 파이프 클램프에 장착합니다. 두 개의 고무 마개와 두 개의 금속 클램프를 사용하여, 이후 단계에서 바늘이 손상되지 않도록 바늘을 수 밀리미터 들어 올린 다음 현미경 기둥을 뒤로 밀어냅니다. 시린지 플런저를 눌러 압력을 높입니다.

0.5에서 2cm³까지. 손상을 입힌 단층이 포함된 커버 슬립이 들어 있는 페트리 접시를 배치합니다. 관찰 스테이지에서 현미경을 뒤로 뺍니다.

필라를 수직 위치로 이동시켜 컨덴서가 바늘이 액체 속으로 진입할 수 있도록 정렬되게 합니다. 이때 커버슬립 위에서 바늘이 부러지지 않도록 주의하여 수행해야 합니다. 10x 대물렌즈를 사용하여 교차 상처의 중심을 확인하고, 주입할 세포 위에 바늘을 위치시킵니다.

40 x 대물렌즈로 교체하여 배율을 높입니다. 그런 다음 조이스틱의 미동 나사를 사용하여 바늘을 내리고 중앙에 맞춥니다. 바늘을 내려 핵에 접촉시켜 상처 십자 모양의 한쪽 모서리부터 주입을 시작합니다.

주입이 완료되면 세포의 위상 밝기에 뚜렷한 변화가 나타납니다. 상처 십자문의 한쪽 모서리를 따라 계속 진행하십시오. 시각화 과정에서 주입된 세포를 쉽게 식별하기 위해서는 각 바늘에 맞게 주입 압력을 적절히 조정하는 것이 매우 중요합니다.

압력은 세포질 막과 핵막을 관통할 수 있을 정도로 충분히 높아야 하지만, 세포를 사멸시킬 정도로 높아서는 안 됩니다. 정해진 시간 동안 상처 가장자리를 따라 세포를 미세 주입하십시오. 숙련되면 이 시간 동안 수백 개의 세포를 주입할 수 있습니다.

플라스미드 DNA를 주입한 경우, 고정 전 조직 배양 인큐베이터에서 미세 주입된 세포를 37 °C에서 20분 동안 배양한 후 전사를 종결시킵니다. 이를 위해 성장 배지에 용해된 1 µg/mL의 alpha-amanitin으로 세포를 처리합니다. 이 농도는 미세 주입된 플라스미드로부터의 전사를 효과적으로 억제합니다.

세포를 다시 인큐베이터에 넣고 새로 합성된 mRNA가 세포 밖으로 배출되도록 합니다. 하나의 바늘로 여러 개의 커버 슬립에 주입할 수 있습니다. 다만, 미세 주입하는 DNA 또는 RNA의 종류가 변경된 경우에는 바늘을 교체해야 합니다.

또한, mRNA 핵 수출 역학의 정확한 측정을 위해 바늘을 완드에서 제거한 후 즉시 폐기해야 합니다. 0분, 15분, 30분, 60분, 120분 시점에 각각 별도의 샘플을 고정해야 합니다. 적절한 시간에 alpha manin 처리를 마친 후, 배양액을 흡입하여 제거하고 2 mL의 PBS 용액으로 세포를 두 번 세척합니다.

커버 슬립이 액체에 잠겨 있지 않은 시간을 최소화하여 습윤 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 4% Aldehyde (PBS에 희석) 2 mL를 첨가하여 세포를 고정하고, 상온에서 최소 15분 동안 배양하십시오. 고정된 시료를 두 번 더 세척한 후, 0.1% Triton X 100 (PBS에 희석) 2 mL를 사용하여 세포를 투과성 있게 만들고, 다시 상온에서 최소 15분 동안 배양하십시오.

마지막으로 하이브리다이제이션(hybridization)을 준비하기 위해 샘플을 두 번 더 세척합니다. 25~60% formamide가 포함된 1X SSC 세척 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다. 그 후, 150 mm 페트리 접시 바닥에 물을 채우고 그 위에 파라필름(parafilm) 조각을 띄워 하이브리다이제이션을 위한 염색 챔버를 준비합니다.

디쉬를 뒤집어 물을 제거함으로써 파라폼이 디쉬 바닥에 부착되도록 합니다. 염색할 각 커버슬립의 기포를 수동으로 제거합니다. 파라폼 위에 하이브리드화 용액 100 µL를 피펫으로 떨어뜨립니다.

포셉을 사용하여 사용 중인 특정 물고기 표본에 맞게 포마주(formage)의 양을 최적화해야 함에 유의하십시오. 30 millimeter 페트리 접시에서 고정된 세포가 있는 커버슬립을 제거합니다. 왓만(Watman) 여과지를 사용하여 커버슬립의 뒷면을 말리고, 세포가 마르지 않도록 주의하며 앞면의 과잉 완충액을 흡수시킵니다.

그런 다음 커버 슬립을 물고기 용액 위에 아래 방향으로 놓습니다. 각 커버 슬립에 대해 이 과정을 반복합니다. 염색 챔버의 덮개를 다시 닫은 후, 샘플을 37 °C에서 5~18시간 동안 배양합니다.

염색 챔버를 준비한 것과 동일한 방식으로 여러 개의 세척 챔버를 준비합니다. 각 커버슬립에 대해 세척 챔버의 파라필름 위에 세척 완충액 1 mL를 피펫팅합니다. 배양 후, 1 mL의 세척 완충액을 피펫팅하여 염색 챔버에서 커버슬립을 제거합니다. 커버슬립 옆으로 액체가 모세관 현상에 의해 각 시료의 아래쪽으로 흡수되어야 합니다.

그 후 핀셋으로 커버슬립을 제거하고, 실온에서 5분간 배양한 세척 완충액 한 방울 위에 각각 놓습니다. 각 커버슬립을 두 번 더 세척하여 총 세 번의 세척 과정을 거칩니다. 이전에 세척한 슬라이드 위에 DAPI가 포함된 마운팅 용액 10~30 µL를 피펫으로 분주합니다. 핀셋과 Watman 여과지를 사용하여 하나의 슬라이드에 두 개의 커버슬립을 올릴 수 있습니다.

커버슬립의 뒷면을 건조시키고, 샘플이 마르지 않도록 주의하며 커버슬립 앞면의 과잉 액체를 흡수시켜 제거합니다. 각 커버슬립을 마운팅 용액 한 방울 위에 앞면이 아래로 향하게 놓습니다. 마운팅된 샘플은 4°C에서 보관할 수 있습니다.

여기에서는 alpha mantin을 다양한 농도로 전처리한 NIH 3T3 섬유아세포에서 주입된 플라스마 DNA의 전사에 미치는 alpha mantin의 효과를 보여줍니다. 이 세포들에 TFL s delta i 플라스마 DNA와 OG 접합 70 kDa 덱스트란을 주입하였습니다. 각 행은 OG 70 kDa 덱스트란과 T uts delta I mRNA에 대해 이미징된 단일 시야에 해당합니다.

약물의 고농도에서는 T UTS delta I 전사체의 생성이 완전히 억제된 것이 분명한 반면, 저농도에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았습니다. 여기에 mRNA 핵 수출 소요 시간의 시계열 분석 결과가 제시되어 있습니다. 7개의 세포에 T UTS delta i 플라스미드 DNA와 OG 접합 70 kilodalton 덱스트란을 주입하였습니다.

세포 주입 30분 후, $\alpha$-mantin으로 처리하고 37 °C에서 0분, 60분 및 120분 동안 배양하였습니다. 이후 세포를 고정하고 T UTS delta I mRNA에 대한 프로브와 ER 마커인 trap $\alpha$에 대한 항체로 염색하였습니다. 각 행은 단일 세포 시야에 해당합니다.

mRNA 수출을 정량화하는 방법에 대한 정보는 여기의 온라인 텍스트를 참조하십시오. 120분 시점의 이미지를 확대하였습니다. ER 내 TFS delta I mRNA의 공국소화를 입증하기 위해, 녹색의 T UTS delta I mRNA와 적색의 trap alpha를 중첩하여 보여줍니다. mRNA를 단백질과 함께 염색하는 방법에 대한 정보는 온라인 텍스트에서 확인할 수 있습니다.

지금까지 미세주입법을 통해 mRNA의 핵 수출 역학을 측정하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 성공적인 미세주입을 위해 적절한 준비가 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. DNA 및 RNA 준비, 샘플 준비, 니들 추출, 광학 장비 정렬 및 미세주입 문제 해결과 같은 주요 단계는 서면 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

미세 주입된 mRNA를 이미징하고 분석할 때는, 주입된 액체의 90% 이상이 핵으로 들어간 세포로만 정량 분석을 제한하는 것이 중요합니다. 성공적인 핵 주입 여부는 핵과 세포질 내 organ green dextran의 분포를 시각화하여 평가할 수 있습니다. 어류 프로브 설계 및 세포질과 핵 내 mRNA 분포 분석을 위한 이미지 분석 소프트웨어 사용에 관한 자세한 내용은 온라인 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.