바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

이 절차에서는 기지의 바이러스와 미지의 바이러스 모두를 분석하기 위해 임상 시료를 분석하는 범바이러스 마이크로어레이 분석법인 Viro 칩을 사용합니다. 먼저 임상 시료에서 핵산을 추출합니다. 다음으로, 추출된 RNA를 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사합니다.

두 번째 가닥 CD NA 합성을 수행하고, 무작위 PCR을 통해 CD NA 라이브러리를 증폭합니다. 그 다음, 증폭된 cd NA를 형광 염료로 표지하고 바이러스 칩 마이크로어레이에 하이브리드화합니다. 마지막 단계는 마이크로어레이를 스캔하고 분석하는 것입니다.

최종적으로, 칩 마이크로어레이 분석을 통해 하나의 바이러스 또는 여러 바이러스의 존재 여부를 확인하는 결과를 얻을 수 있습니다. 폐렴과 같은 일반적인 임상 증후군은 특정 병원체에만 국한되지 않으며, SARS 코로나바이러스 및 2009년 신종 H1N1 인플루엔자 바이러스와 같은 새로운 바이러스성 병원체의 위협이 계속해서 나타나고 있기 때문에, 진단 미생물학 분야에서는 바이러스 칩 마이크로어레이와 같은 광범위 검출법이 필요합니다. 이 방법은 임상 현장에서 진단되지 않은 감염 중 어느 정도의 비율이 아직 확인되지 않은 신종 바이러스에 의해 발생했는지와 같은 진단 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 수백에서 수천 가지의 잠재적 병원체를 동시에 검사하므로, 이 기술의 활용 범위는 병원 내 급성 임상 질환의 더 나은 진단으로까지 확장됩니다.

우리는 2002년 UCSF의 Joseph DeRisi 박사 연구실에서 개척한 최신 마이크로어레이 기술을 바이러스 검출에 적용하기로 결정하면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 우리의 첫 번째 실제 사례는 2003년 SARS의 원인이 되는 새로운 코로나바이러스를 식별하기 위해 바이러스 칩을 사용한 것이었습니다. 전체 절차의 시연은 제 연구실의 기술자가 담당하며, 어린이의 비강 면봉 검체에 바이러스 칩 분석법을 사용하여 급성 호흡기 질환의 원인을 진단하는 과정을 보여줄 것입니다. 비인두 면봉 검체는 바이러스 수송 액체 배지가 들어 있는 멸균 용기에 수집되어 -80 °C 냉동고에 냉동 보관됩니다.

생물안전 작업대 내에서 샘플이 담긴 튜브를 해동하고, 배지 속의 면봉을 짧게 저어준 뒤 면봉을 생물학적 위험 폐기물 함에 버립니다. 그런 다음 샘플 200 µL를 1.5 mL 튜브에 분주합니다. 바이러스 입자를 정제하기 위해 샘플을 0.22 µm 스핀 필터에 통과시켜 새로운 1.5 mL 튜브에 수집합니다.

다음으로, 제조사의 지침에 따라 Ambien의 Turbo DNA 키트를 사용하여 호스트 게놈 DNA를 분해하고 캡슐화되어 보호된 바이러스 핵산을 정제합니다. 이어서 XMO ZR 바이러스 RNA 추출 키트 또는 Qiagen 초음파 바이러스 키트를 사용하여 제조사의 지침대로 RNA를 추출합니다. 추출된 RNA의 농도는 NanoDrop 핵산 분광광도계를 사용하여 측정합니다.

RNA 농도는 µL당 최소 10 ng인 것이 좋으나, 얇은 벽의 200 µL 튜브를 사용할 경우 샘플마다 다를 수 있습니다. 추출된 RNA 4 µL에 40 pmol/µL 농도의 프라이머 A 1 µL를 첨가하십시오. 서모사이클러에서 샘플을 65 °C로 5분 동안 가열한 후, 튜브를 실온에서 5분 동안 식히십시오.

다음으로, 2 µL의 5× RT buffer, 1 µL의 12.5 mM dNTP, 1 µL의 물, 0.5 µL의 0.1 M DTT 및 0.5 µL의 superscript three 역전사효소가 포함된 마스터 믹스 5 µL를 써모사이클러(thermocycler)에 넣습니다. 튜브를 42 °C에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 94 °C로 2분 동안 가열합니다.

역전사 반응을 중단시키기 위해, 10 °C에서 2분 동안 유지한 후 5초 동안 짧게 원심분리합니다. 다음으로, 1 $\mu\text{L}$의 5$\times$ quease 완충액, 3.8 $\mu\text{L}$의 물, 그리고 0.15 $\mu\text{L}$의 quease 제2 가닥 합성물로 구성된 5 $\mu\text{L}$의 quease 믹스를 첨가합니다. 써모사이클러의 온도를 8분에 걸쳐 10 °C에서 37 °C까지 올립니다.

37 °C에서 8분 동안 유지합니다. 그런 다음 94 °C에서 2분 동안 가열하여 효소를 불활성화한 후, 이 시점에서 10 °C까지 냉각합니다. 필요한 경우, 15 µL의 cDNA가 포함된 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오.

먼저, 5 µL의 CD NA 샘플을 5 µL의 10x PCR 버퍼, 1 µL의 12.5 mM dNTP, 1 µL의 100 pmol/µL 프라이머 B, 1 µL의 cleantech LA 및 37 µL의 증류수로 구성된 45 µL의 마스터 믹스에 첨가합니다. 그 후, 94 °C에서 2분간 반응시킨 뒤, 94 °C에서 30초, 50 °C에서 45초, 72 °C에서 1분간 진행하는 과정을 25회 반복하는 PCR 프로토콜을 수행합니다.

그 후 72 °C에서 5분간 어닐링 단계를 거치고, PCR 종료 후 10 °C에서 유지합니다. 1.5% agarose 전기영동 겔을 사용하여 PCR 산물을 확인합니다. 약 200에서 1000 base pairs 사이의 스미어(smear)가 관찰되어야 합니다.

AAD DNTP를 포함시키기 위해, 5 µL의 바이러스 PCR 생성물을 10배 농도의 PCR 버퍼 5 µL, 12.5 mM AAD NTP 1 µL, 다중 마이크로리터 프라이머 B 1 µL, ClinTech LA 1 µL 및 물 37 µL로 구성된 마스터 믹스 45 µL에 첨가합니다. PCR 프로토콜을 다음과 같이 수행합니다: 94 °C에서 2분, 94 °C에서 30초, 50 °C에서 45초를 15회 반복합니다.

72°C에서 1분간 가열하고, 72°C에서 5분간 어닐링 단계를 거친 후 10°C에서 유지합니다. 그다지 제조사의 지침에 따라 DNA clean and concentrator three kit를 사용하여 새로운 PCR 생성물을 정제하고 10 µL의 elution buffer로 용해합니다. 10 µL의 PCR 생성물에 1 M bicarbonate 1 µL와 si three 1 µL를 첨가하고 암소에서 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, DNA clean and concentrator five 키트를 사용하여 S 라벨 샘플을 다시 정제하고 12 µL의 용출 버퍼(elution buffer)로 용출합니다. NanoDrop 분광광도계를 사용하여 cDNA 농도와 결합된 염료의 양을 확인하기 위해 샘플 1.5 µL를 사용합니다. PCR 스트립 튜브에 1 µL의 25배 농도 분절 버퍼(fragmentation buffer) 5 µL, 5배 농도 블로킹 버퍼(blocking buffer) 9.5 µL, 또는 SI3 라벨 샘플의 최종 농도가 10 pM/µL로 정규화되는 데 필요한 양과 물을 넣어 총 부피를 25 µL로 맞춥니다. 그 후 2x GX 하이브리다이제이션 버퍼(hybridization buffer) 25 µL를 첨가하고, 짧게 원심 분리하여 기포를 제거합니다.

새 가스켓 슬라이드를 하이브리다이제이션 챔버에 넣습니다. 가스켓 슬라이드 위에 샘플 40 µL를 로딩합니다. 다음으로, Agilent라고 표시된 면이 아래로 향하도록 Agilent 프린티드 바이러스 어레이를 가스켓 슬라이드 위에 올리고 나사를 단단히 조입니다.

하이브리다이제이션 챔버를 65 °C 오븐에 넣고, 분당 10회의 저속 회전을 사용하여 밤새 하이브리다이제이션을 진행하여 어레이를 세척합니다. 먼저 버퍼 2를 37 °C로 예열합니다. 500 mL 플라스틱 용기에 버퍼 1을 약 250 mL 채웁니다.

하이브리다이제이션 챔버에서 어레이를 꺼내어, 어레이를 담근 후 가스켓 슬라이드에서 분리합니다. 어레이를 깨끗한 용기로 옮겨 버퍼 1로 1분 동안 세척합니다. 그다음 별도의 500 milliliter 플라스틱 용기를 사용합니다.

미리 가열한 버퍼 2로 1분 동안 어레이를 세척합니다. 세척 후, 기포가 생기지 않도록 주의하며 버퍼 2에서 어레이를 천천히 꺼냅니다.

킴와이프(kim wipe)를 사용하여 어레이의 활성 면에 직접 닿지 않도록 주의하면서 여분의 수분을 제거합니다. 마지막으로, 슬라이드를 Agilent 면이 위로 향하게 하여 슬라이드 홀더에 넣고 어레이 스캐너에 삽입합니다. 본 과정에서는 Agilent 2 micron DNA 마이크로어레이 스캐너를 사용합니다.

기기 표준 스캔 프로토콜에 따라 SI 3개 표지 어레이를 5µm 또는 2µm에서 스캔합니다. 클러스터 분석 또는 자동화된 RO 칩 분석 프로그램인 e unpredic를 사용하여 바이러스 칩 마이크로어레이를 분석합니다. Viro Chipp 마이크로어레이 2009를 사용하면 인플루엔자 유사 증상을 보이는 아동으로부터 얻은 비강 면봉 검체에서 신종 인플루엔자 H1N1 바이러스를 쉽게 검출할 수 있습니다.

또한, 본 바이러스 칩이 호흡기 바이러스뿐만 아니라 다양한 조직 및 체액에서 유래한 광범위한 바이러스를 식별할 수 있음을 확인하였습니다. 여기에서 보여주는 vichi를 이용한 전혈 및 혈청 내 바이러스 검출의 몇 가지 사례입니다. 이는 전혈 또는 혈청으로 채취한 4명의 환자 샘플 각각에 대한 viro chip 마이크로어레이 결과이며, P 값이 가장 낮은 상위 2개의 바이러스 예측 결과가 표시되어 있습니다.

예를 들어, 연한 파란색으로 강조 표시된 샘플의 경우, 해당 샘플에 대한 최상위 예측 결과는 뎅기 바이러스 1형입니다. 두 번째 순위의 예측 결과는 뎅기 바이러스 2형이었으나, 해당 전혈 샘플 내의 실제 바이러스는 dict 결과와 일치하게 뎅기 바이러스 1형인 것으로 확인되었습니다. Viro chip의 또 다른 응용 분야는 신종 병원체 발견입니다.

몇 가지 예로는 sars coronavirus X-M-R-V-A, 인간의 전립선암 및 만성 피로 증후군과 연관된 OME retrovirus, 그리고 어린이의 호흡기 및 설사 감염과 관련된 새로운 인간 심장 바이러스인 HTCV의 발견 등이 있습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 12시간 내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 이 절차에 따라 필요한 모든 장비와 시약이 준비되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다.

특이적 바이러스 PCR 증폭 및 심층 시퀀싱(deep sequencing)과 같은 다른 방법들을 통해, 개발 이후에 나타난 비정상적인 바이러스 칩 하이브리드화 패턴이나 새로운 바이러스의 존재를 암시하는 바이러스 칩 결과를 확인하고 추적 관찰할 수 있습니다. 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 신종 바이러스와 암의 연관성을 탐구하고, 생물방어 및 임상 미생물학 분야에서 신속한 병원체 진단을 위한 응축 마이크로 기반 분석법을 개발하며, 바이러스학 분야에서 신종 바이러스의 특성화 및 질병과의 연관성을 규명하는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 임상 시료에서의 핵산 추출부터 마이크로어레이 하이브리드화 및 분석에 이르기까지, 임상 시료 내 바이러스 병원체를 검출하기 위한 광범위 감시 검사인 바이러스 칩 마이크로어레이 분석의 모든 단계를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

임상 시료를 다루는 작업은 생물학적 위험이 있는 것으로 간주되므로, 핵산 추출은 생물안전등급 2단계(biosafety level two) 이상의 실험실에서 수행해야 함을 잊지 마십시오.