마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 미세유체 칩을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는 것입니다. 먼저 SPE 채널을 통해 용해 완충액이 있는 샘플을 실행하여 바이러스를 용해시키고 RNA를 추출하여 추출된 RNA와 함께 R-T-P-C-R 시약을 로드하고 역전사 채널을 실행하여 바이러스 RNA를 CDNA로 변환합니다. 다음으로, DNA 증폭을 위해 혼합물을 PCR 채널로 실행하면 모세관 전기영동의 형광 신호를 기반으로 앰플리콘의 크기와 농도를 보여주는 결과를 얻을

이 기술의 가장 큰 장점은 원시 환자 샘플을 수용하고 핵산 추출, 정제, 역전사 및 증폭을 단일 칩으로 통합하여 두 개의 플라크를 만들고 금속판 중앙에 약 9g의 XN X 펠릿을 고르게 분배하고 섭씨 198도의 가열 프레스에 5분 동안 놓습니다. 그런 다음 5분 동안 2, 500PSI까지 천천히 압력을 가합니다. 이제 에폭시 몰드에 플라크 하나를 놓고 섭씨 157도에서 10분 동안 예열하고 10분 동안 1000PSI까지 천천히 압력을 가합니다.

그런 다음 보온 장갑을 착용하고 핫 프레스에서 플라그와 곰팡이를 제거한 다음 냉각되기 전에 곰팡이에서 플라그를 제거합니다. 엠보싱 칩에 미세유체 채널의 입구, 폐기물 포트 및 출구에 각각 하나씩 세 개의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 IPA로 칩을 씻은 다음 RNA와 dianna의 물로 씻습니다.

칩을 공기로 건조시켜 칩을 접착하고 먼저 섭씨 131도에서 10분 동안 예열한 다음 350PSI에서 다시 10분 동안 누릅니다. JB Weld Epoxy를 사용하여 입구 폐기물에 나노 포트를 부착하고 출구 포트를 15-24 시간 동안 별도로 경화합니다. 제조업체의 지침에 따라 50마이크로리터의 RNA로 SPE 채널을 헹구고 100마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물로 헹굽니다.

이제 SPE 채널에 4 마이크로 리터의 갓 준비된 접목 용액을로드하여 UV 오븐에서 10 분 동안 메타 크릴 레이트 배양을 가교하고 진공 청소기로 잔류 접목 용액을 제거합니다. 뚜껑을 닫은 상태에서 튜브를 두드려 건조된 마이크로스피어 펠릿을 분해합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 새로 준비된 SPE 컬럼 용액과 와류를 추가하여 혼합합니다.

4마이크로리터의 SPE 용액을 각 측면에서 2.5분 동안 UV 조사에 의해 동일한 채널 가교에 로드하여 불투명한 흰색 중합 SPE 컬럼을 생성합니다. 500마이크로리터의 100% 메탄올로 채널을 세척하여 과도한 반응물과 고분자 내 발열성 용매를 헹굽니다. 열전도성 테이프로 칩 바닥에 두 개의 박막 히터를 부착합니다.

히터의 측면은 Dene 지속 시간 동안 넓은 채널의 가장자리와 정렬되어야 하며 별도로 무릎을 꿇고 각 칩 테이프의 막다른 개방형 측면 채널을 통해 칩에 5개의 열전대를 배치합니다. 열전대의 위치를 수정하려면 한 튜브에 96 마이크로 리터의 70 % 에탄올에 4 마이크로 리터의 25 XRNA 보안을 추가하고 두 번째 튜브에 100 % 에탄올을 추가합니다. 또한 300마이크로리터의 채널 버퍼와 316마이크로리터의 용해 버퍼를 준비합니다.

용액을 섭씨 60도에서 15분 동안 가열합니다. 안전한 RNA를 활성화하기 위하여, 그 후에 microfluidic 수로를 평형화하기 위하여. SPE 채널을 통해 채널 버퍼를 시간당 0.8밀리리터의 유속으로 실행합니다.

이제 섭씨 37도에서 VTM의 빠른 파바 테스트 샘플. 샘플을 제거하십시오.amp해동되자마자. 13, 000 RPM에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.

100 마이크로 리터의 상등액을 300 마이크로 리터의 용해 완충액으로 옮기고, 마이크로 리터 캐리어 당 1 마이크로 그램의 6 마이크로 리터, RNA 와류를 첨가하여 혼합합니다. 그런 다음 5초 동안 회전하고 전체 용해물을 루어 잠금 CC 주사기 1개에 로드합니다. SPE 채널을 통해 용해물을 시간당 0.8밀리리터의 유속으로 실행합니다.

그런 다음 SPE 채널을 100마이크로리터의 70% 에탄올로 세척한 다음 시간당 1밀리리터로 100% 에탄올 100마이크로리터로 세척합니다. 빈 주사기를 0.5ml 표시에 놓고 채널을 통해 공기를 밀어 시간당 1밀리리터로 건조시킵니다. 이제 채널을 통해 67.5마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 실행하여 결합된 핵산을 시간당 0.5밀리리터로 용리하고 폐기물 포트의 나노 포트에서 13.5마이크로리터를 수집합니다.

R-T-P-C-R 마스터의 36.5마이크로리터를 로드합니다. 폐기물 포트의 나노 포트를 혼합하고 50 마이크로리터 R-T-P-C-R 반응을 위해 템플릿 RNA와 혼합합니다. 그런 다음 부드러운 진공으로 R-T-P-C-R 혼합물을 RT 채널에 로드합니다.

닫힌 피팅으로 나노 포트를 밀봉합니다. 히터 하나에 35볼트를 가합니다. 히터 1이 섭씨 30도에서 평형을 이룬 후 50분 동안 RT 채널에 시약을 보관하십시오.

히터 1이 섭씨 15도에서 평형을 이룬 후 95분 동안 RT 채널에 시약을 보관하십시오. 다음으로, 히터 1에 27볼트, 히터에 50볼트, 평형 히터에 2볼트, 섭씨 60도에서 1볼트, 섭씨 95도에서 히터 2를 적용합니다. 시약을 분당 0.5마이크로리터의 속도로 PCR 채널로 밀어 넣습니다.

약 20분 후 시약이 구불구불한 채널의 끝에 접근하면 애질런트 고감도 DNA 검사를 위해 적절한 크기의 피펫터와 팁을 사용하여 배출구에서 PCR 산물을 수집합니다. 검사 30분 전에 애질런트 고감도 DNA 키트를 냉장고에서 꺼냅니다. 바이오분석기를 켜고 2, 100 전문가 소프트웨어를 엽니다.

테스트를 위해 1마이크로리터의 PCR 산물을 로드하고 애질런트 프로토콜을 따릅니다. 이 워크플로우에서 데이터를 분석하고 기록합니다. 환자의 비강 인두 샘플을 용해 완충액과 혼합하여 칩에 적용합니다.

칩이 실행되고 인플루엔자 바이러스의 PCR 산물은 상업용 모세관 전기영동 칩을 사용하여 빨간색입니다. 각 환자의 검체에서 인플루엔자 바이러스의 양이 다르기 때문에 PCR 산물의 최종 농도는 다양합니다. 양호한 결과는 35 및 10, 380 염기쌍 및 양성 샘플에 대해 설계된 제품 크기인 107 염기쌍에서 단일 제품 피크를 제거하는 데 노이즈가 낮아야 합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위해 마이크로 유체 칩을 제작하고 실행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.