Clonogenic 분석 : 자기편 셀

안녕하세요, 제 이름은 Lum이며 현재 Epigenomic Medicine Lab의 책임자인 Dr.Tom Carianne의 지도 아래 BE IDI Heart and Diabetes Institute에서 박사 과정을 밟고 있습니다. 이번 영상에서는 Clon Genic Survival Assay라고 알려진 절차를 시연하겠습니다. 이 기술은 50년 전에 개발된 기법으로, 방사선 노출이나 화학 물질 처리와 같은 다양한 처치가 세포의 생식 능력(reproductive viability)에 미치는 영향을 평가할 수 있게 해줍니다.

동종성 생존 분석(Congenic survival assay)은 다양한 세포주의 방사선 민감도를 평가하고, 다양한 방사선 보호제 또는 방사선 감작제의 효능을 테스트하는 방사선 생물학의 핵심 기술입니다. 부착성 세포주를 사용할 때, 저온 생존 분석은 세 단계로 구성됩니다. 첫 번째는 부착성 세포 단층의 처리 단계입니다.

둘째로, 단일 세포 현탁액의 준비와 정해진 수의 세포를 도말한 플레이트 준비 과정이며, 셋째로, 일정 기간의 배양 후 염색, 계수 및 형성된 콜로니를 확인하는 과정입니다. 본 영상에서는 불멸화된 인간 시노사이트(cino site) 세포를 사용하여 천연 항산화제의 방사선 보호 특성을 결정하는 데 다핵성 돌기 분석법(polygenic Bible assay)을 어떻게 활용할 수 있는지 시연하겠습니다. 실험 당일에 플라스크당 100만 개의 세포가 확보될 수 있도록, 사전에 5 mL의 배지가 담긴 T25 플라스크에 세포를 분주해 두었습니다.

적절하게 라벨이 부착된 각 플라스크의 배지 5 mL에 필요한 농도가 되도록 서로 다른 농도의 약물을 50 µL씩 첨가하며, 이 경우에는 다섯 가지 농도와 하나의 용매 대조군인 PBS를 사용합니다. 약물을 첨가한 후, 사용된 세포주에 적합한 조건에서 세포를 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 대조군을 제외한 플라스크에 세슘 감마선원으로 생성된 4 Gy의 선정된 선량으로 조사를 수행합니다.

조사 후, 배지를 따라내고 각 플라스크를 2 mL의 PBS로 5분 동안 세척합니다. PBS를 따라낸 후, 플라스크에 부착된 세포를 분리하기 위해 0.05% trypsin 2 mL를 각 플라스크에 첨가합니다. 그 다음, trypsin을 비활성화하기 위해 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM 5 mL를 각 플라스크에 첨가합니다.

그 후 fasc의 전체 내용물을 라벨이 부착된 10 milliliter falcon tube로 옮깁니다. 옮기기가 완료되면, 이 튜브들을 5분 동안 원심분리하고, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 각 튜브에 5 mils의 crecy media를 첨가합니다. 각 샘플의 세포 농도를 계산하고, 샘플당 5 milliliter의 배지가 담긴 5개의 Petri dish에 도말하기 위한 최종 세포 농도를 맞추기 위해 필요한 각 샘플의 부피를 산출합니다.

예를 들어, 대조군의 경우 디쉬당 100개의 세포를 플레이팅하므로, 25 milliliters당 500개의 세포를 달성하는 데 필요한 부피를 계산합니다. 더 농축된 샘플의 경우, 100 microliters 미만의 부피를 사용할 때 발생하는 오차를 최소화하기 위해 10배 희석 또는 100배 연속 희석을 수행합니다. 이제 이전에 계산된 부피를 각 샘플에 대해 25 milliliters의 배지가 들어 있는 Falcon 튜브에 준비합니다. 이제 샘플을 이전에 라벨링한 디쉬로 옮길 수 있으며, 취급과 운반을 용이하게 하기 위해 각 디쉬에 5 milliliters씩 추가합니다.

디쉬를 크고 멸균되었거나 소독된 용기에 보관하십시오. 그런 다음 디쉬를 적절한 조건의 가습 인큐베이터에 넣고 8일 동안 배양합니다. 8일 후에 각질 형성 세포(keratinocytes)를 사용하는 경우, 인큐베이터에서 디쉬를 조심스럽게 꺼내 흄 후드 내부에 하나씩 펼쳐 놓으십시오.

형성된 콜로니가 손상되지 않도록 플레이트를 조심스럽게 다루십시오. 뚜껑을 열고 각 디시에 0.9% saline 5 mL를 첨가하여 세척합니다. 피펫 팁을 디시의 모서리 방향으로 조준하고 디시 바닥에 닿지 않게 하여 콜로니가 실수로 긁혀 나가지 않도록 주의하십시오.

5분 후, 식염수를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이제 4% 포뮬러 3 mL로 콜로니를 고정하며, 증발을 방지하기 위해 덮개를 다시 닫아야 합니다. 15분에서 30분 후, 포뮬러를 흡입하여 제거하고 적절하게 폐기합니다.

이제 콜로니를 0.1% Crystal violet으로 염색할 준비가 되었습니다. 각 디쉬에 5 mL를 첨가하고 30분에서 1시간 후에 뚜껑을 닫습니다. 그 다음 증류수로 염료를 씻어내고, 디쉬를 뒤집어 하룻밤 동안 건조시킵니다. 이제 콜로니를 계수할 준비가 되었습니다.

해부 현미경을 사용하여 콜로니 수를 수동으로 측정할 수 있습니다. 50개 이상의 세포를 포함하는 모든 세포 집단은 하나의 콜로니로 간주합니다. 이것으로 동계 생존 분석법(Congenic survival assay) 시연을 마치겠습니다.

다른 기술과 비교했을 때 이 분석법의 주요 장점은 감도가 매우 뛰어나 세포가 6 log만큼 사멸한 후에도 넓은 범위에서 생존 여부를 검출할 수 있다는 점입니다. 이러한 감도는 더 많은 수의 세포를 도말함으로써 달성됩니다. 이 분석법은 세포 독성 테스트와 같은 다른 목적으로도 쉽게 활용될 수 있습니다.

시청해주셔서 감사합니다.