편광 상피 세포에 Plasmids의 Microinjection에 의해 작은 GTPases의 기능을 분석

본 절차는 소형 GTP ACE가 분극화된 막 수송에 미치는 영향을 분석합니다. 먼저, 소형 GTP ACE와 리포터 단백질을 인코딩하는 DNA 플라스미드를 분극화된 세포의 핵 내로 공동 주입합니다. 그 다음, 소형 GTPA가 세포질에 축적되는 동안 리포터 단백질이 소포체 또는 TGN에 정지될 수 있는 온도에서 DNA를 발현시킵니다. 이어서, 추가적인 단백질 합성을 방지하기 위해 cyclo heide를 처리한 상태에서 리포터 단백질이 세포 표면으로 이동하도록 체이스(chase) 과정을 진행합니다.

마지막으로, 면역형광 분석을 위해 세포 표면의 리포터 단백질을 표지합니다. 이 분석을 통해 얻은 결과는 공초점 현미경을 통해 표면 국소화의 변화를 시각화할 수 있게 해줍니다. 형질전환과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 미세 주입으로 달성되는 짧은 과발현 시간 동안 이차적 효과가 최소화되어 관심 단백질의 일차적 효과를 연구할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 작은 GTPase가 어떻게 극성 막 수송을 조절하는지와 같은 세포 극성 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 성공적인 미세주입에 필요한 개별 단계들은 시각적 보조 자료 없이는 설명하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep kit를 사용하여 엔도톡신이 없는 플라스마 DNA를 분리하십시오. 본 실험에서는 배양을 위해 공극 크기가 0.4 µm인 투명한 12 mm transwell 필터 3개를 사용하십시오.

필터당 4 × 10⁵개의 MDCK 세포를 분주합니다. 2일 후, 현미경으로 배양 상태를 관찰하여 세포가 닫힌 단층(closed monolayer)으로 성장했는지 확인합니다. 마이크로인젝션을 위해.

미세주입 당일에, 5L의 MM 배지와 15mM HEIS를 혼합하여 360 x 15mm 플레이트를 준비하고 39°C 인큐베이터에 넣습니다. 또한, 1mL의 MEM 배지, 50mM HEIS 및 0.1mg/mL cycloheximide를 혼합하여 12웰 플레이트 3개를 준비하고 31°C 인큐베이터에 넣습니다. 미세주입 현미경의 전원을 켜고, 가열 스테이지와 10x 및 32x 대물렌즈, 그리고 einor femto jet이 장착된 도립 현미경을 설정합니다.

가열 스테이지를 39 °C로 설정하십시오. 또한 에어 테이블로 연결되는 질소 가스 탱크 공급 밸브를 여십시오. 이제 DNA를 여과수로 희석하여 최종 농도가 0.2 mg/mL가 되도록 하십시오.

그 후 DNA를 마이크로 원심분리기에서 13,000 RPM으로 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 새 튜브에 옮깁니다. 다음으로, 수술용 칼을 사용하여 배양 접시에서 첫 번째 필터를 꺼내어 MDCK 세포를 준비합니다. 필터 홀더에서 필터를 잘라내어 39 °C로 데운 5 mL의 MEM 성장 배지와 50 mM HEPES가 들어 있는 준비된 60 x 15 mm 플레이트에 넣습니다.

배양 플레이트 내의 필터를 고정하기 위해, 필터 중앙에 수술용 칼날을 놓은 다음 배양 플레이트를 현미경의 가열 스테이지 위로 옮깁니다. 희석된 DNA 2~3 µL를 미세주입 바늘에 충전합니다. 바늘의 보호 캡을 돌려 제거한 후 바닥으로 떨어뜨립니다.

바늘을 홀더에 배치하려면, 주입기의 메뉴 키를 누르고 밸브가 닫혀 있는지 확인하십시오. 바늘을 홀더에 돌려 끼웁니다. 이때 바늘을 너무 세게 조이지 않도록 주의하십시오.

파손의 위험이 있으므로 메뉴 키를 다시 누르십시오. 이렇게 하면 적용된 보정 압력이 미세주입 과정 중 배지가 바늘 안으로 흡입되는 것을 방지합니다. 마지막으로 조이스틱을 탭하여 저장된 홈 위치를 지우고 바늘을 세포 위로 내립니다.

10배 대물렌즈를 사용하여 액체 위의 광선 속으로 바늘을 위치시킵니다. 이제 세포에 초점을 맞추십시오. 초점 조절 휠을 위로 180도 돌려 다시 초점을 높여 바늘을 찾으십시오.

바늘을 천천히 초점으로 이동시킵니다. 그런 다음 다시 초점에서 벗어나게 합니다. 다시 세포의 초점을 맞추기 위해 조절합니다.

바늘의 초점을 다시 맞춥니다. 바늘이 배지의 표면에 닿아 헤일로(halo)가 관찰될 때까지 이 과정을 반복합니다. 세포에 초점이 맞지만 바늘은 여전히 초점 평면 밖에 있어 흐릿하게 보일 때까지 계속 진행합니다.

이제 32배 대물렌즈로 전환하고 조동나사를 조절합니다. 바늘 끝으로 apical membrane에 접촉한 후 약 10 µm를 빼서 Z축 제한 범위를 설정합니다. 핵이 apical membrane 아래로 약 10 µm 지점에 위치하기 때문입니다.

이제 바늘을 초점 평면에서 수 마이크론 위로 최대한 빠르게 이동시키십시오. 바늘 끝이 핵 위에 오도록 맞춘 다음, 조이스틱의 주입 버튼을 눌렀다 떼십시오. 적절한 주입 압력을 찾기 위해 95 PSI부터 시작하십시오.

압력이 너무 높으면 세포가 파열됩니다. 압력이 너무 낮으면 흰색 점이 지속되지만, 그 외에는 아무런 반응이 일어나지 않습니다. 세포 크기의 변화 없이 상전이가 일어나는 성공적인 주입을 수행하십시오.

세포 위에 놓인 수술용 칼날의 구멍 안에 100~500개의 세포를 주입합니다. 그다지 세포가 담긴 배양 접시와 수술용 칼날을 39 °C 인큐베이터에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 1 mL의 MEM 및 50 mM 0.1 mg/mL cyclo heximide가 준비된 12-well 플레이트에 세포를 옮기고 31 °C에서 2시간 동안 배양합니다.

발현된 GFP 신호의 광퇴색을 방지하기 위해, 이후의 모든 표면 염색 과정 동안 알루미늄 호일로 덮어 시료를 빛으로부터 보호하십시오. 배양 접시에 담긴 세포를 얼음 위에 놓인 금속판 위에 올리고 세척합니다. 우선 얼음처럼 차가운 PBS++로 세척한 후, 얼음 위 금속판에 깨끗한 파라폼 조각을 배치하고 표적 단백질의 엑토 도메인을 인식하는 항체를 30 µL씩 떨어뜨립니다.

이제 세포가 포함된 필터를 액적 위에 뒤집어 놓은 다음, 필터 뒷면에 항체를 몇 방울 떨어뜨립니다. 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 세포를 ice cold PBS++로 3회 세척하고, 실온에서 3% paraform aldehyde로 15분 동안 고정합니다.

PBS++로 세포를 한 번 세척한 후, PBS++에서 5분 동안 평형화합니다. 이제 세포를 투과성 블로킹 버퍼(blocking permeable buffer)에서 배양합니다. 실온에서 1시간 동안 배양하고, 발현된 RAB GTP ACE를 검출하기 위해 1차 항체를 BPB로 1:200으로 희석합니다. 13,000 RPM에서 10분 동안 원심 분리합니다. 습윤 챔버(wet chamber)에 놓인 깨끗한 파라필름 위에 항체 용액 30 µL를 피펫으로 분주합니다.

필터를 뒤집어 세포가 항체 방울에 닿도록 배치하고 1시간 동안 배양합니다. 실온에서 세포를 다시 정방향으로 12-well 플레이트에 옮기고, 적절한 2차 항체와 함께 배양한 후 세척 단계를 포함하여 실온에서 BPB로 30분 동안 5회 세척합니다.

필터 위의 세포를 탈이온수에 세 번 담근 후, 10 µL의 마운팅 용액이 도포된 마이크로 슬라이드 위에 정방향으로 올립니다. 그 위에 18 by 18 mm 마이크로 커버 글라스를 덮고, 안면 조직(facial tissues)을 사용하여 커버 슬립을 세포 방향으로 부드럽게 누릅니다. 마지막으로 매니큐어로 밀봉합니다. VSV-G-TS045-GFP를 인코딩하는 플라스미드만을 사용하는 모의 주입(mock injection)의 경우, 단백질이 잘 분극화된 MDCK 세포의 기저외측 표면으로 전달되며, 이는 잘 분극화되지 않은 세포에서 나타나는 붉은색 표면 염색을 통해 판단할 수 있습니다.

GFP 융합 단백질의 일부가 정단막으로 전달될 것입니다. 대조군 시료가 이와 같이 보인다면 데이터를 신뢰할 수 없으며, 더 잘 분극화된 세포를 사용하여 실험을 반복해야 합니다. 전체 단백질에 대한 광범위한 세포 내 녹색 신호에서 알 수 있듯이, 31 °C에서 추적하는 동안 발현된 모든 GFP 융합 단백질이 기저측막으로 전달되는 것은 아니라는 점에 유의하십시오. 이 기술을 숙달하면 개발 후 약 10~12시간이 소요됩니다.

이 기술은 막 수송(membrane trafficking) 분야의 연구자들이 분극화된 상피세포 내의 조절 단백질을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 미세주입법(microinjection technique)을 사용하여 분극화된 상피세포에서 단백질을 발현시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.