자기 공명 영상 준비, 정화하고, 명암 요원 이용 란탄족 단지의 특성화

본 실험 절차의 전반적인 목표는 생체 고분자 표지에 사용할 수 있는 란타넘족 함유 착물을 합성, 정제 및 분석하는 것입니다. 이는 먼저 용액의 pH를 조절하면서 금속 출발 물질과 리간드를 혼합함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 투석을 이용하여 생성된 착물을 정제하는 것입니다.

다음으로, 유리 금속의 부재를 확인해야 합니다. 이 절차의 마지막 단계는 영상 촬영과 관련된 복합체의 특성을 분석하는 것입니다. 최종적으로, 이완 활성 측정(relax activity measurements)을 통해 합성된 복합체가 조영제로 작용함을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 조영제가 단백질과 결합할 때 물 배위수가 변하는지 여부와 같이 영상 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 필요한 개인들은 pH를 세밀하게 조절하지 못하면 LI를 생물학 교육에 사용할 수 없게 되므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 투석 및 활성 측정 과정을 시연하는 것은 Buda와 Sashi가 담당할 것입니다.

란타넘족 염을 이용한 메테이션(methation)을 시작하기 위해, 먼저 리간드 1 당량을 물에 녹여 30~265 mM 농도의 용액을 조제합니다. 여기서는 Paraiso Benzyl DTPA 리간드를 73 mM 농도로 사용합니다. 다음으로, 1 M 암모늄 하이드록사이드를 첨가하여 리간드 용액의 pH를 5.5에서 7 사이로 조절합니다.

이 영상에서는 1 M 암모늄 하이드록사이드 용액 0.2 mL를 사용하여, 물에 용해된 1~2 당량의 란타넘족 염화물을 녹여 5~1000 mM 농도의 용액을 제조합니다. 유로븀 염화물 또는 가돌리늄 염화물을 111 mM 농도로 사용할 수 있습니다. 대개 정제를 간편하게 하고 반응을 완결시키기 위해 금속을 과량으로 사용합니다.

다음으로, 교반하면서 준비된 리간드 용액에 각각의 란타넘 염 용액을 첨가합니다. 이제 0.2 M 수산화암모늄을 첨가하여 생성된 반응 혼합물의 pH를 5.5에서 7 사이로 조절합니다. 이때 용액의 pH를 조절하기 위해 총 0.5 mL의 0.2 M 수산화암모늄 용액이 사용됩니다.

사용하는 리간드에 산에 민감한 작용기가 포함되어 있는 경우, 이 단계 동안 pH를 여러 번 조정하십시오. 용액이 너무 염기성으로 변하면 Isothiocyanate와 같은 염기에 민감한 작용기를 사용할 수 없게 되므로, pH 조정 시 주의하시기 바랍니다. 결합 과정에서는 pH 측정을 통해 반응을 면밀히 모니터링하십시오.

pH가 일정하게 유지되면 반응이 완료된 것입니다. 염기에 민감한 작용기가 없는 리간드의 경우, pH를 높이는 방식의 후처리 과정이 유용할 수 있습니다. 투석 후처리를 시작하려면, 시료 부피를 수용할 수 있는 적절한 길이의 투석 튜브 길이를 결정하고, 시료 부피의 10%를 추가로 수용할 수 있는 여유 길이를 더하십시오. 그다음 제조사 지침에 따라 튜브를 해당 길이로 절단하십시오.

본 영상에서는 100~500 Dalton 분자량 컷오프 막을 사용하였으나, 상황에 따라 더 큰 분자량 컷오프 튜빙을 사용할 수 있습니다. 적절한 경우 접합을 메테이션 이전에 수행하십시오. 제조사의 지침에 따라 절단된 투석 튜빙을 상온의 물에 15분 동안 담가 두십시오. 다음으로, 투석액으로 사용할 물을 투석 저장조에 채웁니다. 여기서는 1L 비커가 사용되었습니다.

투석액의 부피는 시료 부피의 약 100배가 되어야 합니다. 이제 튜브의 한쪽 끝을 두 번 접고, 접힌 부분을 투석 폐쇄 클램프로 고정합니다. 투석 중에 닫힌 상태가 유지되도록 폐쇄된 끝부분을 고무줄로 감쌉니다.

이전에 준비한 반응 혼합물을 0.2 micron 필터로 여과합니다. 그런 다음 여과액을 튜빙의 열린 끝부분에 넣습니다. 이때 튜빙이 찢어지지 않도록 주의하십시오.

튜브를 닫을 수 있도록 충분한 헤드 스페이스를 남겨두십시오. 튜브의 남은 열린 끝부분을 두 번 접은 다음, 마개로 고정하고 마개를 고무줄로 감싸십시오. 다음으로, 공기가 들어 있는 유리 바이알을 다른 고무줄을 사용하여 투석 튜브 한쪽 끝의 클램프에 부착하십시오.

그런 다음 모래가 들어 있는 바이알을 다른 클램프에 부착하십시오. 이 바이알들은 튜브가 투석액에 계속 잠겨 있도록 보장합니다. 이제 튜브 전체를 투석액이 들어 있는 투석 저장조에 넣으십시오.

상온에서 자석 교반기를 사용하여 투석액을 저속으로 교반합니다. 교반 속도를 낮게 유지하여 용액에 볼텍스(vortex)가 발생하지 않도록 주의하십시오. 하루 동안 투석액을 세 번 교체합니다.

본 영상에서는 투석액을 2.5, 6.5, 11.5시간에 교체합니다. 총 20에서 28시간 동안 밤새 투석을 계속 진행하십시오. 투석이 완료되면 튜브를 투석액에서 제거하고, 한쪽 밀폐 장치를 조심스럽게 열어 샘플을 꺼냅니다.

투석 튜브를 물로 3회 세척하고, 세척액을 샘플과 합칩니다. 마지막으로, 여기에서 감압 상태로 샘플의 물을 제거합니다. 이는 동결 건조를 통해 수행됩니다.

시료를 동결시킨 후 동결 건조 장치에 놓습니다. 시료 내 유리 금속의 존재 여부를 평가하기 위해, 먼저 아세트산 1.4 milliliters를 물 400 milliliters에 녹여 아세테이트 완충액을 준비하고, 1 molar 수산화암모늄으로 pH를 5.8로 조절한 뒤 물을 추가하여 최종 부피를 500 milliliters로 맞춥니다. 그런 다음 각 착물을 0.3 milliliters의 완충액에 0.3 milligrams씩 녹입니다.

이제 pH 5.8 완충액 내에서 16 micromolar 농도가 되도록 xol orange 지시약을 준비합니다. 이 지시약 용액 3 milliliters를 이전에 용해시킨 금속 착물에 첨가합니다. 지시약의 색이 노란색에서 보라색으로 변하는 것을 관찰하여 유리 금속의 존재를 검출합니다.

원하는 경우, 검정 곡선을 작성하여 유리 금속의 양을 정량할 수 있습니다. 유리 금속이 남아 있다면, 특성 분석 전 투석이나 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 시료를 추가로 정제해야 합니다. 다음으로, opium 시료의 수분 배위수를 결정하기 위해, 물에 약 1mM 농도로 opium 함유 복합체 용액을 준비하고, 이어서 중수(deuterium oxide)에 동일한 농도의 또 다른 용액을 준비하십시오.

분석 전, 잔류 수분을 제거하기 위해 중수(deuterium oxide) 용액을 증발시키고 다시 중수에 녹이는 과정을 세 번 반복합니다. 분광 형광 광도계(spectro fluorimeter)의 전원을 켜고, 깨끗한 큐벳(vete)에 수용액을 넣은 후 큐벳을 분광 형광 광도계에 배치합니다. 이제 여기(excitation) 및 방출(emissions) 측정을 수행하여 각각 약 395 nanometers와 595 nanometers에서 최대치를 결정합니다. 다음으로, 방금 결정한 여기 및 방출 파장과 여기에 표시된 매개변수를 사용하여 인광 시간 감쇠(phosphorescence time decay) 실험을 수행합니다.

준비된 중수(deuterium oxide) 용액으로 이 단계를 반복하십시오. 방금 얻은 발광 감쇄 데이터로부터 강도의 자연로그 값과 시간의 관계를 그래프로 나타냅니다. 이 직선들의 기울기가 감쇄 속도입니다. 이 영상에서는 원시 데이터로부터 자연로그 그래프를 생성하기 위해 Microsoft Excel 2007을 사용하였습니다.

여기 제시된 Hors 및 공동 연구자들이 개발한 방정식의 붕괴율을 사용하십시오. 리간드에 금속과 배위 결합된 OH 또는 NH 그룹이 포함되어 있는 경우, 사용 전 방정식을 수정해야 합니다. 샘플의 상대적 측정값을 결정하려면 먼저 완화 시간 분석기에서 T1 또는 T2 중 원하는 응용 모드를 선택하십시오.

여기서는 T1 설정이 선택됩니다. 다음으로, 수성 용매에 서로 다른 농도의 란타넘족 함유 착물을 포함하는 일련의 시료를 준비합니다. 여기서는 물이 용매로 사용되며, 용액의 농도는 10, 5, 2, 0.5, 1.25, 0.625 및 0입니다.

밀리몰(Millimolar) 농도로 준비합니다. 다른 적절한 용매나 완충액을 사용할 수 있으나, 해당 용매를 블랭크(blank)로 사용하는 것이 중요합니다. 시료의 최종 부피는 사용하는 기기에 따라 다릅니다.

시료를 기기에 넣고, 본 영상에서 사용된 장비의 설정 온도인 37 °C에서 온도 평형이 이루어지도록 5분 동안 둡니다. 이제 T1 또는 T2에 대해 매끄러운 지수 곡선을 얻을 수 있도록 소프트웨어 매개변수를 조정하여 초 단위의 완화 시간을 측정합니다. 공백 시료(blank)를 포함한 모든 시료에 대해 이 과정을 반복합니다.

이제 측정된 T one 또는 T two 이완 값의 역수를 계산하여 그래프로 나타냅니다. 이 값들을 밀리몰(millimolar) 단위의 Lathan 농도에 대해 도식화하고 직선으로 피팅합니다. 피팅된 직선의 기울기가 이완 활성도가 되며, T one의 경우 R one, T two의 경우 R two가 됩니다.

여기서 메틸화 및 정제에 대한 일반적인 체계를 볼 수 있습니다. 이 체계는 메틸화의 일반적인 절차와 서로 다른 정제 경로를 선택하는 이유를 보여줍니다. 여기서는 대표적인 발광 감쇠 도표를 볼 수 있는데, 여기서는 감쇠의 자연로그를 시간에 대해 도식화하였습니다. 물과 중수($\text{D}_2\text{O}$) 용액에 대해 유사한 곡선으로부터 생성된 직선의 기울기를 식 1에 대입하여 $\text{Eu}$ 함유 복합체의 수분 배위수를 결정합니다.

활성도(livity) 측정의 대표적인 예가 여기에 제시되어 있으며, 적합된 직선의 기울기가 시료의 T₁ 활성도가 됩니다. 프로토콜에 설명된 물 배위수 및 활성도 분석 외에도, 표준 화학적 기법을 사용하여 최종 생성물을 분석하는 것이 중요합니다. 화합물의 정체는 질량 분석법을 통해 확인할 수 있으며, 가돌리늄(gadolinium)과 오븀(opium) 함유 착물의 특징적인 동위원소 패턴을 보여주는 대표적인 질량 분석 스펙트럼이 여기에 제시되어 있습니다.

이 절차에 이어, 생성된 착물을 더욱 상세히 분석하기 위해 ENDR 분광법, HPLC 및 원소 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 생체 고분자 표지에 사용할 수 있는 란타넘족 함유 착물을 합성, 정제 및 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.