인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

본 절차는 원심분리를 통해 인플루엔자 바이러스 용액에서 모든 부유물을 제거하는 것으로 시작합니다. 그 다음 세제로 바이러스 막을 파괴하며, 방출된 vRNPs를 글리세롤 밀도 구배를 이용하여 분리합니다.

기울기 원심분리 분획을 수집하고 각 분획의 일부를 분석합니다. SDS-PAGE를 수행하고 젤을 쿠마시 블루로 염색하여 V NP가 포함된 피크 분획을 결정합니다. V NP가 포함된 분획을 원심분리로 농축한 후, 정제된 VRP를 구리 TEM 시편 그리드에 도포하고, 투과전자현미경으로 VRP를 시각화하기 위해 음성 염색을 진행합니다. 안녕하세요, 저는 브리티시 컬럼비아 대학교 동물학과의 Nellie Pane 박사 연구실의 WinCo Wu입니다.

저는 이전 Pane Lab 소속이었던 Lindsay Weaver입니다. 오늘은 바이러스 리보핵산단백질 복합체인 인플루엔자의 정제 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 조직 배양 세포 내 인플루엔자 A 바이러스의 핵 내 유입을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 실험을 시작하기 위해 11 mm x 34 mm Beckman 폴리카보네이트 원심분리관에 MNT buffer 750 µL를 넣습니다. 다음으로, 2 mg/mL 농도의 influenza A virus 용액 500 µL를 튜브에 추가하고, 피펫팅을 여러 번 반복하여 바이러스와 MNT buffer를 혼합합니다.

혼합 후, 튜브를 TLA one 20.2 로터에 넣고 Beckman Optima max E 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 109,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 제거한 다음, 500 µL의 파쇄 완충액(disruption buffer)에 펠렛을 재현탁하고 볼텍싱합니다. 재현탁된 펠렛을 강하게 볼텍싱한 후, einor thermo mixer에서 31 °C로 20분 동안 흔들어 섞어줍니다.

교반이 완료되면 글리세롤 기울기 침강 속도 원심분리를 진행합니다. 글리세롤 기울기를 준비하려면 Beckman UltraClear 13 millimeter by 51 millimeter 원심분리 튜브에 다음과 같이 글리세롤을 넣습니다: 70% (volume by volume) GLYCEROL 1 milliliter, 50% glycerol 0.75 milliliter, 40% glycerol 0.375 milliliter, 33% glycerol 1.8 milliliters. 이 글리세롤 용액들은 순수 글리세롤을 NM buffer와 혼합하여 제조합니다.

글리세롤과 완충액이 모두 포함된 평형 튜브(balance tube)도 준비합니다. 그런 다음, 파쇄된 바이러스 샘플을 다시 한번 볼텍싱하고 이를 글리세롤 기울기(glycerol gradient)에 로딩합니다. 튜브를 Beckman MLS 50 스윙 버킷 로터(swinging bucket rotor)에 넣고 4 °C에서 217,000 ×g로 3시간 45분 동안 원심분리합니다.

원심분리가 완료되면, 튜브 상단부터 250 µL씩 구배액을 수동으로 분취합니다. 분취액은 얼음 위 또는 4 °C에서 보관하십시오. 분취가 완료되면, SDS poly acrylamide gel electrophoresis를 사용하여 이를 분석할 준비가 된 것입니다.

SDS page 분석을 시작하려면, 각 분획에서 20 µL를 취해 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 5배 농축 SDS page 샘플 버퍼 5 µL를 첨가하고, 샘플을 95 °C에서 5분 동안 가열합니다. 가열 후 샘플을 짧게 원심 분리하여 가라앉히고, 이를 10% Poly acrylamide 젤에 로딩하며, 웰 하나에는 분자량 마커를 포함시킵니다. 다음으로, brom phenol blue 로딩 염료가 젤 바닥 근처에 도달할 때까지 샘플을 전기영동합니다.

SDS page 장치에서 겔을 꺼내어 쿠마시 블루(kumasi blue)로 염색합니다. 염색 결과에 따라 주로 인플루엔자 뉴클레오단백질(nucleo protein)이 포함된 분획을 확인합니다.

인플루엔자 A NP의 크기는 약 56 kilodaltons이며, 바이러스 리보핵산단백질 복합체에서 발견되는 주요 단백질입니다. 따라서 일반적으로 NP 밴드는 vRNP가 포함된 분획에서 가장 강한 밴드로 나타납니다. 다음 단계에서는 이러한 vRNP 분획을 농축하겠습니다.

주로 NP를 포함하는 글리세롤 분획들을 합친 후, 이를 두 개의 Beckman 11 mm x 34 mm 폴리카보네이트 원심분리 튜브에 나누어 담고, 각 튜브를 ethyl pyro carbonate 또는 DEPC 처리된 초순수로 채웁니다. 그다음 피펫으로 여러 번 상하로 섞어줍니다. 튜브를 Beckman TLA 120.2 로터에 넣고 4 °C에서 157,000 ×g로 4시간 30분 동안 원심분리합니다.

원심분리가 완료되면 상층액을 제거하고 펠렛을 재현탁합니다. 정제된 V NPS를 50 µL의 DEPC 처리된 물 분주액에 현탁한 후, 한 개의 분주액은 따로 떼어 두고 나머지는 -80 °C에서 보관합니다. 이제 VRP의 음성 염색을 진행할 준비가 되었습니다.

정제된 VRNP 1 µL를 갓 제조하여 두 번 여과한 PBS 버퍼 9 µL에 희석하고, 구리 TEM 시료 그리드를 30초 동안 글로우 방전 처리합니다. 이 그리드는 이전에 Parlow Dion과 탄소 필름으로 코팅된 것입니다. 갓 글로우 방전 처리된 시료 그리드를 핀셋으로 잡고, 희석된 VRNP 5 µL 한 방울을 시료 그리드 위에 도포합니다.

기다리는 동안 방울이 그리드에 흡수되도록 8분간 둡니다. 트레이에 파룸(parfum) 조각을 작게 놓은 다음, 파룸 위에 PBS 버퍼 10 µL가 포함된 방울 두 개와 1% ammonium mellite로 구성된 갓 제조한 염색액 80 µL 방울 하나를 분주합니다. 이제 시료 그리드를 두 개의 PBS 방울에 조심스럽게 담가 총 1분 동안 세척합니다.

그런 다음, 시료 그리드가 마르지 않도록 주의하면서 거름종이 조각을 사용하여 시료 용액의 일부를 흡수하여 제거합니다. 시료 그리드에서 버퍼의 마지막 한 방울을 제거한 즉시, 시료 그리드를 염색액 방울 속에 완전히 담급니다. 그리고 1분 동안 기다립니다.

1분 후, 새로운 거름종이를 사용하여 시편 그리드에서 염색액을 완전히 흡수하여 제거합니다. 관찰 전 시편 그리드를 수분 동안 자연 건조시킵니다. 투과 전자 현미경으로 관찰한 음성 염색된 V nps의 대표적인 투과 전자 현미경 이미지입니다.

여기서 보시는 바와 같이, V NPS는 길이가 가변적인 막대 모양의 입자와 유사하며, 길이는 약 30 nanometers에서 120 nanometers 정도입니다. 올리고머 NP는 NP 분자들이 사슬 형태로 조직되어 있으며, 이는 다시 이중 나선 반복 구조로 접혀 있습니다. 따라서 이러한 막대 모양 입자의 양 끝단에서 루프 구조가 때때로 관찰될 수 있습니다.

인플루엔자 바이러스 리보핵단백질 복합체(vRNP)를 정제하고 시각화하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 음성 염색을 위해 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)를 사용하는 경우 vRNP를 희석할 때 PBS를 사용하지 않는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.