단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정

본 실험 과정의 전반적인 목표는 BioRad DUO flow 중압 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여, 자동 스카우팅 방법을 통해 재조합 단백질 정제에 최적화된 HI 액체 크로마토그래피 컬럼을 선정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 필요한 완충액과 표적 재조합 단백질이 포함된 박테리아 용해물을 준비합니다. 그 다음, duo flow 크로마토그래피 시스템을 물리적으로 설치하고 배관을 연결하여 스카우팅 프로토콜을 수행할 수 있도록 준비합니다.

그 후 샘플을 로딩하고 프로그램된 HI 컬럼 스카우팅 방법을 실행하여 분획 샘플 EIT를 수집합니다. 마지막으로, EIT를 분석하여 관찰된 분리 특성을 기반으로 최적의 HI 컬럼과 충전제를 식별합니다. 최종적으로 DUO flow 자동화 HI 컬럼 스카우팅 기능을 이용한 중압 액체 크로마토그래피를 통해, 연구자가 관심 있는 단백질의 스케일업 정제에 적합한 HI 컬럼 충전제 결과를 얻을 수 있습니다.

수동 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 실행하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 공정을 자동화함으로써 변동성을 줄이고 결과의 재현성을 높일 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 현대 액체 크로마토그래피 시스템의 물리적 복잡성으로 인해 어려움을 겪을 수 있으나, 이는 충분히 숙달 가능합니다.

충분한 연습 후, 본 절차의 시연은 제 실험실의 학생인 Orange Stone과 Shelly Anderson이 진행하겠습니다. 먼저 다음의 버퍼들을 500 mL씩 준비하십시오: 버퍼 A1용 200 mM sodium phosphate, 버퍼 A2용 200 mM sodium hydrogen phosphate, 그리고 버퍼 B2용 4.8 M ammonium sulfate입니다. 버퍼 B1으로는 탈이온수를 사용합니다. 최적의 크로마토그래피 작동 조건을 보장하기 위해 버퍼들을 탈기하십시오. 시스템 Maximizer가 버퍼 A1과 A2를 혼합하여 저염 phosphate 용출 버퍼를 생성하며, 버퍼 B1과 B2를 혼합하여 고염 ammonium sulfate 버퍼를 생성하게 됩니다.

시작 완충액. 정제할 단백질이 포함된 세포 용해물 10 milliliters와 buffer B two 10 milliliters를 혼합하여 로딩할 샘플 20 milliliters를 준비합니다. 세포 용해물 샘플 용액의 최종 황산암모늄 농도는 약 2.4 molar가 되어야 하며, 이는 시작 완충액과 거의 동일한 수준입니다.

용액에서 입자성 물질을 제거하기 위해 용해물 버퍼 혼합물을 단백질 결합력이 낮은 0.45 micrometer 시린지 필터로 여과하십시오. 샘플은 시스템에 로딩하기 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 크로마토그래피 시스템의 물리적 설치 및 배관 작업은 이 절차에서 가장 복잡한 단계 중 하나입니다.

여기에 표시된 도표에 따라 듀오 흐름 크로마토그래피 시스템을 설정하십시오. 전체 프로토콜에 필요한 충분한 양의 완충액이 준비되었는지, 그리고 튜브가 계속 잠겨 있는지 확인하십시오. 여기에 설명된 대로 샘플 로딩 밸브와 동적 샘플 루프를 연결하고, 샘플 루프를 3번 위치의 샘플 밸브 입구에 연결하십시오.

외경 1/16인치 피크 튜빙을 동일한 크기로 8쌍 준비합니다. 그다음, 이 튜빙 쌍들을 두 개의 컬럼 선택 밸브의 1번부터 8번 위치에 연결합니다. UV 검출기 램프를 켜고 모든 검출기가 보정되었음을 확인한 후, 그림에 표시된 대로 분획 수집기의 스트림 분할 밸브와 분할 컨트롤러를 장착합니다.

포지션 2 분획 수집기 분배 밸브와 분배 컨트롤러는 크로마토그래피 워크스테이션과 별개로 작동됩니다. 분배 비율(percent split)을 10으로 설정하십시오. 포지션 2 분획 수집기의 표준 분획 수집기 드롭헤드를 마이크로플레이트 드롭헤드로 교체하십시오.

샘플 루프를 헹구고 크로마토그래피 시스템을 플러싱합니다. 그다음, 시스템을 통해 전개 버퍼를 분당 1 mL의 속도로 수동 흐름을 시작합니다. 1 mL high trap HI 컬럼을 컬럼 선택 밸브의 2번부터 8번 위치에 연결합니다.

2번 컬럼 선택 밸브를 연결하는 유니온을 제거합니다. 상류 컬럼 피팅을 듀오 플로우(duo flow)에 연결합니다. 모든 공기가 빠져나가고 버퍼 한 방울이 크게 맺힐 때까지 용리 버퍼를 피팅을 통해 흘려줍니다.

다음으로, 컬럼 입구에 연결된 스토퍼를 제거하고 컬럼 상단에 저염 버퍼를 크게 한 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 컬럼을 상류 피팅에 연결하십시오. 출구를 하류 컬럼 피팅과 선택 밸브 튜빙에 연결합니다.

배압 한계를 40 PS.I로 설정하십시오. 1 mL/min의 유속으로 용출 버퍼를 사용하여 컬럼 부피의 5배만큼 컬럼을 세척하십시오. 이어서 1 mL/min의 유속으로 시작 버퍼를 사용하여 컬럼 부피의 10배만큼 컬럼을 세척하십시오.

pH, UV 트레이싱 및 배압(back pressure)이 안정화되면 컬럼 선택 밸브를 수동으로 1번 위치로 전환하고 버퍼 흐름을 중단합니다. 시료를 로딩하려면 시료 주입 튜브를 20 milliliter 시료에 담급니다. 그다음 시료 루프 로드 워시 밸브를 1번 위치로, 시료 로딩 밸브를 퍼지(purge) 위치로 전환합니다.

샘플 루프 로딩 펌프를 작동시켜, 샘플이 샘플 로딩 밸브에 도달한 직후까지 1 mL/min의 유량으로 펌프 튜빙 내에 샘플을 흡입합니다. 샘플 로딩 밸브를 purge에서 load로 전환합니다. biologic 소프트웨어의 설정 창에서 샘플 루프 로딩 펌프를 1 mL/min의 유량으로 다시 작동시켜, 다이내믹 샘플 루프에 10 mL의 샘플이 흡입될 때까지 유지합니다.

이 표에서 별표로 표시된 시스템 장치들을 선택하십시오. 다음으로, 분석 프로그램을 실행할 HIC 컬럼 6개를 선택하십시오. 선형 내림차순 염 농도 구배와 6개 컬럼 스카우팅 방법으로 시작 버퍼 유량을 분당 1mL로 수동 시작합니다.

분할기 컨트롤러의 시작 버튼을 눌러 90%에서 10%로의 EIT 스트림 분할을 시작하십시오. 프로그램 메소드 런을 시작한 직후, 오프라인 96-웰 플레이트 분획 수집기의 온스크린 제어 패널에서 시작 버튼을 누르십시오. 실시간 디스플레이를 관찰하여 예상 실행 파라미터를 확인하십시오. GFP 특이적 397 nanometer 흡광도 트레이싱을 일반 단백질 280 nanometer 흡광도 트레이싱과 비교하여, 스카우팅 중인 서로 다른 HI 배지를 이용한 상대적 분리 및 정제 정도를 추정하십시오. 96-웰 플레이트 분획에서 5 to 50 µL의 aliquot을 새 플레이트로 옮긴 후, ELISA 또는 Western blot으로 특정 단백질 함량을 측정하거나 SDS-PAGE 또는 Experian 미세유체 전기영동 시스템을 사용하여 총 단백질 함량을 분석할 수 있습니다. 여기에는 스카우팅 런의 대표적인 Hick 염 농도 구배 전도도와 컬럼 압력이 표시되어 있습니다.

고염 농도 버퍼 라인에서 유입된 버퍼의 백분율로 측정된 염 농도의 변화는 HI 방법론의 전형적인 특징입니다. 염 농도가 감소함에 따라 컬럼에 결합된 단백질들이 용리되며, 관찰된 전도도와 일치하는 염 농도는 quad tech 및 UV 검출기 직후의 라인에서 측정됩니다. 염 구배와 전도도 추적선 사이의 오프셋은 버퍼가 버퍼 입구에서 시스템을 거쳐 전도도 모니터까지 이동하는 데 소요되는 시간을 나타냅니다.

샘플 분석이 진행되는 동안 시스템 압력과 pH는 비교적 일정하게 유지됩니다. 이 그림은 총 단백질의 인라인 검출을 수행한 순차적인 HI 컬럼 스카우팅 런의 크로마토그램을 보여줍니다. NGFP는 각각 280 nanometers와 397 nanometers에서의 빛 흡광도를 측정하여 달성됩니다.

각 스카우팅 런의 상대적인 GFP 풍부도와 분리 정도를 근사치로 파악할 수 있습니다. 이 그림의 두 라인을 비교하면, fennel FF 스카우팅 런의 분획 10, 12, 14, 16, 18에 해당하는 배양 튜브를 주변광 또는 형광실내등 및 자외선 램프 하에서 전면과 상단 모두에서 관찰하여 특성 GFP 방출 스펙트럼을 확인하였으며, 분획 14에서 GFP가 명확하게 검출되었습니다. 두 UV 이미지 모두에서 왼쪽 UV 패널의 확산된 파란색은 UV 램프에서 방출되는 빛입니다.

이러한 분석 후 데이터는 397 nm에서 용출액의 흡광도를 측정하여 GFP를 인라인으로 검출한 결과와 잘 일치하며, 이를 통해 14번 분획에 용출된 GFP의 주요 피크가 포함되어 있음을 확인할 수 있습니다. 이 절차 이후에, 정제 중인 단백질의 순도 및 기능적 활성과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 웨스턴 블롯팅, ELISA, 원자 힘 현미경 및 생화학적 재구성 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 방법의 여러 지점에서 이중 흐름 시스템을 수동으로 제어해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이에 대한 예로는 버퍼 재충전 및 시료 로딩, 기포 확인, 필요에 따른 검출 램프의 켜고 끄기 등이 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 최적의 HI 컬럼 및 충전제를 자동으로 탐색하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

인라인 및 포스터 분석을 통해 평가함으로써 연구자는 후속 스케일업 정제에 적합한 컬럼을 선택할 수 있으며, 이는 표적 단백질의 순도와 수율을 높이기 위해 다른 크로마토그래피 방법과 결합하여 사용할 수도 있습니다.