단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

이 프로시저의 전반적인 목표는 클론성과 높은 생산성을 갖춘 바이오 의약품용 제조 세포주를 개발하는 것입니다. 이는 먼저 목적 유전자를 인코딩하는 DNA로 숙주 세포를 형질전환함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 FACS를 통해 고생산성 클론을 분리하고, 이어서 클론 셀렉트 이미저(clone select imager)를 통해 콜로니 형성을 기록하는 것입니다.

마지막 단계는 생산성이 높은 클론을 스크리닝하고 선택하는 것입니다. 최종적으로, 역상 HPLC를 통해 연속 배양 및 유가 배양(fed-batch culture)에서의 항체 생산 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법의 시연 영상은 매우 중요한데, 그 이유는 팩트 소팅(fact sorting)과 pcan 80 dgl 단계가 복잡한 설정 과정을 포함하고 있어 학습하기 어렵기 때문입니다. 이에 따라 실험실의 과학자들이 숙주 세포 전이 효과를 위한 형질전환, 콜로니 형성 기록을 위한 Jason Sanders의 소팅, 그리고 Tecan 샘플링을 위한 Russell Kan의 시연을 진행하겠습니다.

이 절차를 시작하기 위해, transfection 하루 전 호스트 세포를 15 mL의 성장 배지가 담긴 세포 배양 플라스크에 접종합니다. 세포를 37 °C, 7.5% CO2 배양기에서 배양합니다. 다음 날, transfection complex를 준비합니다. 먼저, 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 8 µg의 DNA를 무혈청 성장 배지 800 µL에 희석하고 부드럽게 혼합합니다. 그다음, 폴리스티렌 튜브에 40 µL의 lipofectamine을 무혈청 성장 배지 800 µL에 희석합니다.

희석된 DNA를 희석된 Lipofectamine에 추가합니다. 가볍게 섞어준 후 실온에서 30분 동안 배양하여 형질전환을 위한 숙주 세포를 준비합니다. 세포에서 성장 배지를 제거하고 혈청이 포함되지 않은 성장 배지 6.4 milliliters로 교체합니다.

트랜스펙션 복합체 1.6 milliliters를 플라스크에 첨가합니다. 플라스크를 흔들어 부드럽게 혼합합니다. 세포를 이산화탄소 배양기 내 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다.

6시간 후, 플라스크에 8 mL의 성장 배지를 추가하고 이산화탄소 배양기에서 37 °C로 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 흡입법으로 배지를 제거하고 플라스크에 신선한 성장 배지를 추가합니다. 하룻밤 배양 후, 세포를 다시 하룻밤 동안 배양합니다.

성장 배지를 선택 배지로 교체합니다. 이산화탄소 배양기에서 37°C로 2~3주 동안 세포를 배양합니다. 형질전환 후 2~3주가 지나면 유세포 분석 활성 세포 분류법(FACS)을 통한 클로닝이 가능합니다. 플라스크에서 세포를 떼어낸 후 4°C에서 800 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다.

2% bovine serum albumin이 첨가된 선택 배지에 세포를 재현탁합니다. 그다음 형광 표지된 anti-human IgG 항체를 첨가합니다. 1:20 희석액을 첨가하여 얼음 위에서 15분에서 30분 동안 배양한 후, 차가운 PBS로 두 번 세척하고 폴리프로필렌 튜브 내의 1X PBS에 세포를 재현탁합니다.

BD FACS Aria를 이용한 무균 분류를 위해 염색된 세포의 예시가 이 사진에 나와 있습니다. 각 웰에 200 µL의 선택 배지가 담긴 96-웰 세포 배양 플레이트를 준비하십시오. 세포가 든 튜브를 무균적으로 로딩하고 BD FACS Aria로 분석하여, 염색된 세포와 염색되지 않은 세포의 결과를 각각 기록하십시오.

원하는 형광 염색 프로필을 가진 단일 세포를 96-웰 플레이트에 분류하도록 게이트와 설정을 지정합니다. 분류 후 0일, 3일, 7일 및 13일째에 플레이트를 37 °C 인큐베이터에서 2주 동안 배양합니다. 고생산성 클론을 스크리닝하고 선택하기 위해, 클론 선택 이미저를 사용하여 96-웰 플레이트 내의 콜로니 형성을 기록함으로써 단일 세포 유래 클론이 선택되었는지 확인합니다. 먼저 수신 96-웰 분석 플레이트의 샘플 위치를 기록합니다. 그런 다음 로봇 액체 핸들링 시스템을 사용하여 20 µL의 상청액 분취액을 96-웰 분석 플레이트의 각 웰로 전송합니다. 샘플 내의 항체 생산량은 샌드위치법으로 분석합니다.

액체 핸들링 시스템을 사용하여 다음과 같은 방식으로 Human IgG 검출 ELI SA를 수행합니다. 먼저, 샘플과 표준물을 사전 코딩된 bio coat anti-human IgG 분석 플레이트에 로딩합니다. 플레이트를 상온에서 2시간 동안 배양한 후, PBS로 3회 세척합니다.

다음으로 immuno pure goat anti-human IgG HRP를 1:2000 비율로 희석하여 플레이트에 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 플레이트를 PBS로 3회 세척한 다음 ABTS 기질을 첨가합니다.

마지막으로, 플레이트 리더기를 사용하여 405 nanometers의 흡광도로 플레이트를 측정합니다. 이 자동화 플랫폼을 통해, 형광 표지된 anti-human IgG 염색으로 나타나는 세포 표면 항체 수준이 세포의 항체 생산성과 상관관계가 있음을 확인하였습니다. 표면 항체 발현이 높은 세포 집단에서 생성된 상위 2개 클론의 결과에서 볼 수 있듯이, 비생산성은 하루에 세포당 50 내지 70 picograms 범위였습니다.

이와 대조적으로, 표면 항체 발현이 낮은 세포 집단으로부터 생성된 상위 2개 클론의 항체 생산성은 하루당 세포당 약 20 picograms였습니다. 또한, FACS sorting을 통해 개발된 세포주는 수동 한계 희석법으로 클로닝된 세포주보다 항체 생산 측면에서 더 안정적이었습니다. 수동 한계 희석법으로 생성된 상위 클론인 clone one의 비생산성은 80회의 세포 분열 배양 후 약 30 PCD에서 약 10 PCD로 감소하였습니다.

반면, FACS sorting을 통해 생성된 clone two의 최상위 sub clone은 최소 100회의 세포 분열 동안 약 20 PCD의 비생산성을 유지할 수 있었습니다. 형광 인 시튜 하이브리다이제이션(FISH)을 이용한 세포 염색체 내 외래유전자 삽입 부위 확인 결과, clone one은 phenotype A와 phenotype B가 혼합된 집단임이 밝혀졌습니다. 이와 대조적으로, FACS sorting된 clone은 세포의 99.5%가 phenotype A인 더 균일한 집단으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 치료용 단백질 생산을 위한 제조 세포주 개발 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.