HO - Endonuclease의 형성의 Quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 Translocations을 자극 Saccharomyces cerevisiae

본 실험 과정의 전반적인 목표는 이배체 출아 효모 세포 내 단일 가닥 어닐링(single stranded annealing)에 의한 전좌 형성의 유전적 조절을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 특정 유전자형의 단일 콜로니를 배양액에 접종하여 하룻밤 동안 배양합니다. 실험 과정의 두 번째 단계는 배양액에 galactose를 첨가하여 두 개의 염색체 상에서 ho 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의한 동시 이중 가닥 절단을 유도하는 것입니다.

이 배양액들을 다음 단계로 희석하여 선택 배지와 비선택 배지에 도말합니다. 마지막 단계는 선택 배지와 비선택 배지에서 생성된 콜로니 수를 계산하여 전이 빈도를 결정하는 것입니다. 최종적으로, 서로 다른 유전자형을 가진 균주들에서 ho에 의해 자극된 전이 형성 빈도의 변화를 통해, 단일 가닥에 의한 전이 형성의 유전적 조절을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술의 함의는 암 환자의 치료 방사선 노출 결과로 확장되는데, 이는 DNA 이중 가닥 절단과 전좌 형성이 해당 치료의 주요 결과이기 때문입니다. ho 유도 전좌 빈도를 결정하는 절차를 시작하려면, 원하는 유전형의 단일 콜로니를 YP 글리세롤 젖산 배지 1mL 배양액 10~20개에 각각 접종하고, 회전 배양기에서 30 °C로 하룻밤 동안 배양하십시오. 배양액이 원하는 세포 밀도에 도달하면, 최종 농도가 2%가 되도록 20% 갈락토스를 배양액에 첨가하십시오. 갈락토스는 ho 엔도뉴클레아제의 발현을 유도하며, 이는 염색체 3의 his3-delta 5' 대립유전자와 염색체 15의 his4-delta 3' 대립유전자에 이중 가닥 절단을 유도합니다. 이후 회전 배양기에서 30 °C로 4시간 동안 배양하십시오.

다음 단계는 실험 절차의 성공에 매우 중요합니다. 배양액을 세심하게 희석하고 도말하는 것이 필수적입니다. 서로 다른 유전자형을 가진 균주 간에 통계적으로 유의미한 비교가 가능할 만큼 충분히 재현성 있는 전위 빈도를 얻으려면, 4시간 후에 배양액을 적절히 희석하여 히스티딘이 결핍된 배지와 YPD 배지에 각각 도말하십시오. 플레이트당 약 100~200개의 콜로니가 형성되도록 하며, 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다.

콜로니가 형성되면 전좌 빈도를 결정할 수 있습니다. ho 엔도뉴클레아제 발현 유도 전후의 도말 효율을 통해, 전좌 염색체의 존재 또는 부재가 DSB 형성 시 생존 능력에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다. 유도 전 도말 효율을 결정하기 위해 염색체 3번과 15번의 각 한 개 복제본을 절단합니다.

먼저, 하룻밤 동안 배양한 각 배양액에서 세포 분주액을 취하고, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 적절한 희석 배율을 사용하여 YPD 배지에 약 100~200개의 세포를 도말하고, 콜로니가 형성될 때까지 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. 남은 배양액에는 20% galactose를 최종 농도가 2%가 되도록 첨가하고, 30 °C에서 4시간 동안 배양하여 유도 후 도말 효율을 결정합니다.

유도 4시간 후 각 배양액에서 세포 분주액을 채취하고, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 적절히 희석하여 YPD 배지에 약 100~200개의 세포를 도말한 후, 콜로니가 형성될 때까지 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. 플레이트에 콜로니가 형성되면 도말 효율을 결정할 수 있습니다. 전위가 일어난 것으로 추정되는 클론은 Southern blot으로 확인할 수 있습니다.

이 절차에서는 각 독립적인 시험에서 준비된 단일 hiss 플러스 재조합 콜로니로부터 추출한 게놈 DNA를 사용합니다. 각 DNA 샘플 약 4 µg을 BAM H1 제한 효소로 소화시킨 후, BAM H1으로 소화된 단편들을 0.7% agarose 겔에서 분리하고, 이를 양전하 나일론 막으로 전이시킵니다. HIS3 유전자를 포함하는 1.8 kb BAM H1 게놈 클론을 사용하여 random priming 방식으로 제작한 P 32 표지 프로브로 하이브리드화합니다. DNA 단편은 자동 방사선 촬영법 또는 인광 이미징을 통해 시각화합니다. 전좌가 일어난 것으로 추정되는 클론을 검사하는 또 다른 방법으로는 염색체 플롯 분석이 있습니다.

먼저 선택된 hiss plus 재조합체로부터 염색체를 준비하여 aros plug에 넣고, 14°C의 contour clamped homogeneous electric field(CHEF) 환경에서 1% aros gel을 사용하여 염색체를 분리합니다. 사용되는 파라미터는 다음과 같습니다. 첫 번째 블록: 14°C, 스위치 시간 72초, 6 V/cm에서 15시간; 두 번째 블록: 14°C, 스위치 시간 122초, 6 V/cm에서 11시간. 전기영동이 완료되면, 겔을 EtBr로 30분 동안 염색하여 염색체를 시각화한 후, UV를 조사하고 증류수로 탈색합니다. 모세관 현상을 이용하여 염색체를 양전하 막으로 전이시킵니다.

변성 조건에서 his3 유전자를 포함하는 1.8 kilobase bam H one bam H one 게놈 클론을 random priming으로 사용하여 얻은 P 32 표지 프로브와 하이브리드화합니다. 자동 방사선 촬영 또는 인광 이미징을 통해 염색체를 시각화합니다. 염색체 전위 빈도는 YPD 배지에 도말하여 결정한 총 생존 세포 수로 히스토신 영양요구성 콜로니 수를 나누어 계산할 수 있습니다.

이 예시에서 계산된 재조합 빈도는 약 3%입니다. ho 자극 전좌 빈도 분석은 서로 다른 유전자형의 균주를 사용하여 단일 가닥에 의한 이중 가닥 절단 복구 능력의 차이를 비교함으로써 수행할 수 있으며, 이는 이 대표 그래프에 나타난 바와 같습니다. RAD 51 delta null 동형접합체에서 선택적 및 비선택적으로 얻은 전좌 빈도는 유도 전후 플레이팅의 해당 조건에서 야생형 균주를 사용하여 얻은 빈도와 통계적으로 유의미한 차이를 보였습니다.

효율은 이 표에 표시된 유도 전후 도말의 헤모사이토미터 계수로 측정된 배양액 내 총 세포 수로 생존 가능한 콜로니 형성 세포의 총 수를 나누어 결정합니다. 야생형 세포의 경우 효율에 유의미한 차이가 없었으며, 이는 전좌 염색체의 존재 여부가 생존 능력에 영향을 미치지 않음을 시사합니다. DSB 형성.

전이(translocation)가 일어난 것으로 추정되는 클론은 게놈 서던 블롯(genomic southern blot) 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 전이 형성 전후의 관련 염색체에 대한 도식적 표현이 여기에 제시되어 있습니다. 부모 균주와 재조합 균주의 게놈 DNA를 BamHI로 제한효소 절단하여 생성된 관련 서열 포함 제한 단편의 크기는 1.8 kb BamHI 단편과의 하이브리드화를 통한 블롯 분석으로 확인할 수 있습니다.

Southern blot 분석을 위해 HIS3 게놈 클론 3개를 킬로베이스 쌍(kilobase pairs) 단위로 나열하였습니다. 게놈 DNA를 BMH1 엔도뉴클레아제로 절단하고, 진단 단편들을 시각화하기 위해 P 32로 표지된 1.8킬로베이스 HIS3 프로브와 하이브리드화하였습니다.

0.8 kilobase HIS3Δ20, 1.7 kilobase HIS3Δ3', 4 kilobase T315, 5 kilobase T153 및 8 kilobase HIS3Δ5' 단편들입니다. 레인 A는 부모 이배체입니다. 레인 B는 HIS+ 비상호 전좌 재조합체이며, 레인 C는 HIS+ 상호 전좌체입니다.

재조합 염색체 BLO 분석은 전좌를 포함하는 클론을 조사하는 데에도 이용될 수 있습니다. aros 플러그로 준비된 온전한 염색체들을 chef 전기영동으로 분리하고, 겔을 iridium bromide로 염색한 후 UV 광원 아래에서 시각화합니다. 이렇게 분리된 염색체들을 나일론 막에 전이시킨 다음, P 32 표지 1.8 kilobase로 하이브리드화합니다.

1.1 megabase의 온전한 chromosome 15, 8 megabase의 T 15 three 전좌 염색체, 0.6 megabase의 T three 15 전좌 염색체 및 0.3 megabase의 온전한 chromosome three를 시각화하기 위한 세 가지 프로브입니다. Lane A는 부모 균주입니다. Lane B는 his+ 비상호 전좌 재조합체이며, Lane C는 his+ 상호 전좌 재조합체입니다.

이 영상을 시청하고 나면, 다중 Ho 자극에 의한 이중 가닥 절단 이후 전위 형성 빈도를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.